王 榮

湖南省臨武縣人民醫(yī)院藥劑科，湖南 臨武 424300

黃連是臨床常用的藥材，據(jù)來源不同分為“味連”、“雅連”、“云連”等，主產(chǎn)于四川、云南、湖北等地。其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效。現(xiàn)代研究表明其有抗菌作用，且抗菌譜廣，常用于解熱鎮(zhèn)痛、抗腸道細菌感染。

經(jīng)不同方法炮制黃連后，其成分會發(fā)生不同程度的變化，可導致藥性及功能主治的改變[1-2]。黃連的炮制種類繁多，其中酒黃連、姜黃連、萸黃連一直沿用至今，亦為藥典收錄。有學者以甲醇、乙醇等有機溶劑為提取溶劑對黃連不同炮制品提取物進行研究[3]，結(jié)合臨床實際均是采用水煎劑入藥。因此，本文選擇黃連中小檗堿為主要有效成分代表，檢測黃連不同炮制品水煎劑中小檗堿主要含量的變化[4-5]。不同炮制品的功效差異除與其有效成分有關，更與其抗菌活性密切相關[6]。本文研究了黃連不同炮制品中主要成分鹽酸小檗堿含量的變化，及其對常見菌株抗菌活性的影響，為其臨床應用提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1100，美國安捷倫公司）；超聲波清洗器（KQ 3000，昆山市超聲波儀器廠）；電子分析天平（BP211D，德國賽多利斯）；粉碎機（FW200，瑞安市永歷制藥機械有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100715-200821）；黃連藥材（四川產(chǎn)，購于長沙中藥飲片廠），經(jīng)鑒定為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.；流動相所用甲醇、乙腈均為色譜純（美國Fisher公司），水為純化水。乙醇（廣州化學試劑廠，分析純），鹽酸（汕頭市光華化學廠，分析純）。

金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、乙型溶血鏈球菌、沙門氏菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌由臨武縣人民醫(yī)院檢驗科提供。培養(yǎng)基有兩種處方，葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基：牛肉浸出粉0.5%、葡萄糖1%、蛋白胨2%、酚紅0.002%、氯化鈉0.5%、pH 7.4～7.6；固體培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%、瓊脂 2%、蛋白胨 1%、氯化鈉 0.5%、pH 7.2～7.4。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液 （用磷酸調(diào)pH為3.0，27∶73）；柱溫：30℃；流速：1.0 ml/min；檢測波長：345 nm，理論塔板數(shù)在3000以上。

2.1.2 供試溶液的制備

2.1.2.1 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，用甲醇制成每毫升含0.01 mg的溶液，搖勻，即為對照品溶液。

2.1.2.2 供試品溶液制備 取醇提干膏0.05 g，加鹽酸-乙醇溶液（1∶100）100 ml，超聲提取，濾過，取續(xù)濾液，定容，即為供試品溶液。

2.1.2.3 陰性對照溶液制備 按對照品溶液制備方法，除去鹽酸小檗堿，制備陰性對照溶液。

以上溶液按“2.1.1”項下色譜條件進樣，所得圖譜見圖1。

2.1.3 方法學考察

2.1.3.1 線性關系考察 精密稱取對照品溶液，加甲醇稀釋成2.152 mg/ml的溶液，精密吸取對照品溶液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 ml置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻。各取20 μl按上述色譜條件測定。以對照品峰面積為縱坐標Y，對照品進樣量（μg）為橫坐標X，繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=19675506.0322X+15353.6178，r=0.9994，表明鹽酸小檗堿在0.1076～4.3040 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.3.2 精密度試驗 分別精密吸取同一對照品溶液1 μl，連續(xù)進樣5次，求得鹽酸小檗堿對照品峰面積的RSD=6.2%。另外，于同一天不同時間分別進樣測定，求得日內(nèi)RSD=4.56%（n=5）；于不同的5 d同一時間連續(xù)測定求得日間含量RSD=1.68%（n=5），表明儀器精密度良好。

圖1 黃連藥材HPLC圖譜

2.1.3.3 穩(wěn)定性試驗 按照“2.1.2.2”項下方法操作，考察同一供試品溶液放置0、2、5、10、24 h后鹽酸小檗堿含量的變化，結(jié)果顯示，其含量RSD=0.51%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.3.4 重復性試驗 按照“2.1.2.2”項下方法操作，對同一樣品依法測定6次，進樣測定鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果RSD=1.18%，表明本法重復性良好。

2.1.3.5 加樣回收率試驗 精密移取鹽酸小檗堿對照品溶液，加甲醇制成5.38 mg/ml對照品溶液，分別精密吸取上述溶液0.8、1.0、1.2 ml，按低、中、高 3 個量級溶液，定容，過濾，同一量級平行操作2份，計算回收率，結(jié)果鹽酸小檗堿的平均加樣回收率為 98.6%，RSD=1.2%（n=5）。

2.2 黃連不同炮制品的制備

2.2.1 生黃連

取黃連原藥材（成簇者掰開），除去泥沙等雜質(zhì)，搶水洗凈略潤，切薄片，陰涼處干燥。

2.2.2 酒黃連

取黃連片100 g，加入黃酒12.5 g拌勻，稍悶潤，待酒被吸盡后，用文火加熱，炒至表面色變深時，取出，攤涼，篩去碎屑。

2.2.3 萸黃連

取吳茱萸10 g，加適量水煎煮，取汁去渣，煎液與凈黃連100 g拌勻，稍悶潤，待藥液被吸盡后，用文火加熱，炒干，取出，攤涼，篩去碎屑。

2.2.4 姜黃連

取黃連片100 g，用生姜12.5 g或干姜4 g，絞汁或煎汁，取姜汁拌勻，稍悶潤，待姜汁被吸盡后，用文火加熱炒，炒至表面色變深時，取出，攤涼，篩去碎屑。

2.3 供試品溶液的制備

分別稱取生黃連和3種黃連炮制品20 g，經(jīng)粉碎成粗粉備用。稱取粗粉10 g，加純化水100 ml浸泡0.5 h，先以武火加熱，直至煮沸，改以文火加熱，繼續(xù)再煎煮0.5 h。煎煮液以4層紗布過濾，收集濾液備用。濾渣加純化水100 ml，重復加熱、煎煮提取0.5 h，并過濾，收集濾液。合并2次濾液，水浴濃縮，直至濃縮至20 ml，收集生黃連和3種黃連炮制品濃縮液，相當于含生藥0.5 g/ml。精密移取4種濃縮液各2.5 ml，分別加入95%乙醇7.5 ml，攪拌均勻，靜置12 h，傾取藥液上層液，得水提醇沉液，取適量20000 r/min高速離心20 min。取離心液上層清液，將上清液稀釋100倍，相當含生藥1.25mg/ml，制得樣品溶液，備用。

2.4 黃連不同炮制品水煎劑中小檗堿的含量測定

分別精密吸取生黃連和3種黃連炮制品樣品溶液各10 μl注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測定，計算樣品溶液中鹽酸小檗堿含量，測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示各樣品中小檗堿含量排序為：姜黃連＞酒黃連＞萸黃連＞生黃連，其中姜黃連、酒黃連中鹽酸小檗堿的含量明顯高于萸黃連，而生黃連的含量則最低。

表1 黃連生品及其不同炮制品中鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果（mg）

2.5 黃連不同炮制品水煎劑的抑菌實驗

培養(yǎng)基按配方比例煮沸溶解于蒸餾水中，調(diào)pH值后，在121℃高壓滅菌15 min，冷卻到45～50℃后以無菌方式分裝備用。采用混合法進行，將各炮制品水煎液的原液，分別用無菌蒸餾水作等倍稀釋（1/2～1/32），加入雙倍營養(yǎng)瓊脂混合，傾注成平板。將活化后的菌種接種于固體培養(yǎng)基上，分別挑選菌齡12～16 h、濃度80萬/ml的實驗菌液接種，在箱培養(yǎng)37℃溫度下培養(yǎng)。恒溫培養(yǎng)24 h，顯微鏡觀察各細菌在不同藥物濃度中生長情況，如果觀察到不生長的藥物時的濃度，即記錄為該藥液的最低抑菌濃度（MIC）。黃連不同炮制品的抑菌作用，以該藥物的最低抑菌濃度來衡量其對常見細菌的體外抑菌效果。見表2。

表2 黃連及其不同炮制品對不同菌株的最低抑菌濃度（g/ml）

由表2可知，不同炮制品中酒黃連平均MIC最低，為0.23 g/ml，生黃連最高，為0.40 g/ml?？咕鷮嶒灲Y(jié)果表明，生黃連及其不同炮制品對不同細菌顯示了不同的抗菌特性。提示，黃連不同炮制品的水煎液對上述各菌株均有不同程度的抑制作用。

3 討論

黃連及其炮制品中生物堿類化學成分復雜，在研究過程中，筆者考察了流動相的pH、流速的變化、柱溫的變化及樣品不同制備方法、溶劑用量、不同提取時間。根據(jù)上述試驗結(jié)果，確定了本研究中樣品處理條件及色譜條件。本法簡便易行、準確靈敏，重復性好，使用范圍廣，可用于檢驗、評價生黃連及其不同炮制品。

實驗結(jié)果表明黃連經(jīng)炮制后，其總生物堿的含量以鹽酸小檗堿計，由強及弱的順序為：姜黃連＞酒黃連＞萸黃連＞生黃連。但從總體來說，各類型炮制品中鹽酸小檗堿含量要大于生品，因此炮制對黃連中主要成分的含量有一定的影響。

黃連為大苦大寒之品，服用日久易敗胃，臨床中治療癰疽腫毒常用生品，而治療痢疾和腹瀉則常用其炮制品，以防止其寒性太過。黃連中主要有效成分為小檗堿，其具有較強的抑菌作用。實驗結(jié)果顯示，不同炮制品和生品相比也都有一定程度的抑菌作用，但炮制品的抗菌作用稍強。本實驗欲探討黃酒、吳茱萸和生姜對黃連抗菌作用機制的影響，實驗結(jié)果證明黃連炮制后具有明顯的抑菌作用，不同炮制方法對黃連的抗菌作用產(chǎn)生了較大的影響，經(jīng)炮制后黃連不但抑菌活性有不同程度的增強，且減弱其對腸胃道的不良作用，本研究為臨床應用提供了科學依據(jù)，并為進一步的研究打下堅實基礎。

[1]徐景堂,王立群,徐蓓.黃連研究進展[J].中國醫(yī)學科學院學報,2004,26(6):704-707.

[2]龔千鋒.中藥炮制學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2007:160.

[3]任世禾,楊春欣.黃連不同炮制品的質(zhì)量考察[J].中藥材,2007,30(8):915-917.

[4]鄒紅,梅靜,許臘英.不同炮制工藝對黃連中鹽酸小檗堿含量的影響[J].湖北中醫(yī)學院學報,2008,10(1):36-38.

[5]鐘凌云,楊金梅,龔千鋒,等.不同輔料炮制對黃連生物堿類成分的影響[J].中藥材,2010,33(2):195-198.

[6]王紅,徐衛(wèi)賓.黃連不同炮制品體外抗金葡菌和痢疾桿菌實驗[J].山東醫(yī)藥工業(yè),2002,21(1):48-49.