趙洪超

沈陽市蘇家屯區(qū)中醫(yī)醫(yī)院制劑室，遼寧沈陽 110101

香附為莎草科植物莎草Rhizoma cyperi rotundusL.的干燥根莖，其功效為行氣解郁，調(diào)經(jīng)止痛，常用于治療肝郁氣滯，胸、脅、脘腹脹痛，消化不良，胸脘痞悶，寒疝腹痛，乳房脹痛，月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)。香附中主要含有揮發(fā)油類成分，此外還有黃酮類、皂苷類、生物堿類、糖類、酚類和萜類等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，香附中揮發(fā)油以外的成分具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。因此，對香附揮發(fā)油以外成分進行純化富集具有積極意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-1801型紫外分光光度計；HSS型電子恒溫水浴鍋；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵。

1.2 試藥

香附藥材，HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-450型樹脂；AB-8、NKA-9、D101型樹脂；蘆丁對照品（供含量測定用，批號：080-9002，中國藥品生物制品檢定所）；氫氧化鈉；亞硝酸鈉；硝酸鋁。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外分光光度法

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品9.29 mg，用甲醇溶解，將其定容至50 mL容量瓶中，即得到濃度為0.1858 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 檢測波長的選擇 精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，先加入0.3 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，然后加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，最后加入4.0 mL的4%氫氧化鈉溶液，搖勻，靜置15 min。將得到的溶液，用紫外分光光度計，在200～800 nm范圍內(nèi)進行全波長掃描，結(jié)果在510nm有最大吸收峰，故確定檢測波長為510nm。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10mL容量瓶中，先加入0.3 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，然后加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，最后加入4.0 mL的4%氫氧化鈉溶液，搖勻，靜置15 min。再取甲醇定容。用紫外分光光度計，在510 nm測定對照品溶液的吸收度，對照品溶液與吸收度的線性關(guān)系為y=10.314x+0.0506,R=0.9996。香附中總黃酮含量以蘆丁計在0.02～0.08 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 香附中總黃酮成分純化工藝考察

2.2.1 靜態(tài)吸附與解吸實驗（優(yōu)選樹脂）①供試液的制備：準(zhǔn)確稱取香附藥材粗粉100g，10倍量60%乙醇回流提取兩次每次1h，過濾，合并濾液，揮散溶劑，加水定容至500mL量瓶中（0.2g·mL-1）。②樹脂的預(yù)處理：選擇經(jīng)95%乙醇浸泡24h的D101、HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-450、AB-8、NKA-9七種樹脂，濕法上柱，用95%乙醇洗脫，控制流速，待流出液與水1：5混合不產(chǎn)生渾濁后，用大量純化水將樹脂洗至無乙醇味，抽濾，備用。③靜態(tài)吸附與解吸：靜態(tài)吸附：準(zhǔn)確稱取D101、HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-450、AB-8、NKA-9 7種樹脂各1 g，至100 mL錐形瓶中，加入0.2g·mL-1樣品溶液50 mL。每10分鐘振搖20 s，持續(xù)3 h,吸取吸附后溶液,紫外分光光度法測定總黃酮含量。

靜態(tài)洗脫：將靜態(tài)吸附的樹脂，抽濾，加50 mL 95%乙醇解吸，每10分鐘振搖20 s，持續(xù)3 h，吸取解吸液，紫外分光光度法測定總黃酮含量。結(jié)果見表1。

表1 靜態(tài)吸附與解析實驗結(jié)果

靜態(tài)吸附與解析實驗表明，AB-8型號樹脂的飽和吸附量和解析率均相對較高，故確定AB-8樹脂為香附總黃酮純化最佳樹脂。

2.2.2 動態(tài)吸附與解析實驗 ①供試液的制備：準(zhǔn)確稱取香附藥材粗粉100 g，10倍量60%乙醇回流提取2次每次1 h，過濾，合并濾液，揮散溶劑，加水定容至1000 mL量瓶中（0.1g·mL-1）。②泄漏曲線的考察：取已處理好的濕樹脂10 mL，加入0.1g·mL-1的香附提取液，上柱流速調(diào)節(jié)為2 BV/h（每小時2倍樹脂柱體積），收集流出液，每份10 mL，測定其總黃酮含量。結(jié)果表明，上樣至第4份時，流出液中總黃酮含量顯著增大，說明此時開始香附總皂苷明顯泄漏，故確定數(shù)值最大上樣量為30 mL，即樹脂比上柱量為3g/10 mL（藥材/濕樹脂）。③解析液濃度的考察：取已處理好的濕樹脂50 mL，加入0.1g·mL-1的香附提取液50 mL，以5BV（5倍樹脂柱體積）水洗脫后，依次用150 mL的10%、30%、50%、70%、90%乙醇洗脫，流速2BV/h，分別收集各乙醇濃度解析液，揮散溶劑，定容至50 mL量瓶中，測定其中香附總黃酮含量。結(jié)果表明，50%乙醇即可將芍藥苷和白芍總苷進行有效洗脫，因此將50%乙醇確定為最佳洗脫溶劑。④解析液用量的考察：取已處理好的濕樹脂50 mL，加入0.1g·mL-1的香附提取液50 mL，以5BV水洗脫后，用50%乙醇洗脫，流速2 BV/h（每小時2倍樹脂柱體積），每50 mL收集1份洗脫液，測定其種香附總黃酮含量。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫液用量達到5 BV時，已經(jīng)基本將香附總黃酮洗脫干凈，因此確定解吸液用量為5個樹脂柱體積。

2.3 結(jié)果

本試驗針對香附總黃酮分離純化工藝進行研究，7種大孔樹脂中，AB-8樹脂最適合分離純化香附總黃酮，上樣量為香附藥材與樹脂體積比為3∶10(g·mL-1)，采用50%乙醇洗脫5個柱體積效果最佳。

3 討論

大孔吸附樹脂是一類具有較好吸附性能的高聚物吸附劑，當(dāng)前在中藥制劑純化、天然藥物活性成分的提取分離方面也顯示出獨特的作用。

在香附中黃酮含量有限，因此如何有效的純化富集香附中的黃酮成分顯得十分重要。

本實驗考察了不同大孔吸附樹脂對香附總黃酮的吸附和解吸特性，篩選出較為理想的純化富集香附總黃酮的AB-8大孔吸附樹脂，并通過動態(tài)吸附于解析實驗，確定了香附總黃酮的純化富集工藝，純化后的香附總黃酮的純度為香附總黃酮純度為63.44%，原純度為9.24%，純度提高6.9倍。

[1]國家藥典委員會.中國藥典,（一部）[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010: 181.

[2]明·李時珍.本草綱目(校點本上冊)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 1982: 888.

[3]徐燕,李大祥,凌鐵軍,等.香附化學(xué)成分研究進展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2010, 16(11): 214-218.

[4]劉成彬,張少聰,李青天.香附的現(xiàn)代藥理研究進展[J].光明中醫(yī),2009,24(4):787-788.