崔 平， 李軍會， 南 娜， 康 潔， 申景然

(1.河北省人民醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河北石家莊050051;2.石家莊麥格明目眼科門診部，河北石家莊050031;3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院眼科，河北石家莊050011;4.河北省人民醫(yī)院眼科，河北石家莊050051)

白藜蘆醇 (resveratrol，Res)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有多種生物活性的多酚化合物。近年來，已經(jīng)證實(shí)白藜蘆醇具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制血小板聚集保護(hù)心血管、抗炎等多種生物活性和藥理作用，對多種腫瘤 (如鼠肝細(xì)胞癌、乳腺癌等)也具有不同程度的抑制作用［1-2］，但對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的作用研究少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞為研究對象，觀察白藜蘆醇對其增殖的影響，并初步闡明具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞SO-RB50:購自美國ATCC菌種保藏中心。白藜蘆醇、MTT、DMSO購自美國Sigma公司;RT-PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司;PCNA、Cyclin D、Rb、P16、GAPDH一抗均購自美國 Santa Cruz公司;PCNA、Cyclin D、Rb、P16、GAPDH引物根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)并委托上海生工生物工程有限公司合成。

PCNA上游引物:5'-GTGAATTTGCACGTATATGCCG-3'，下游引物:5'-GCAATTTTATACTCTACAACAAGGGG-3'，片段長度302 bp。

Cyclin D1上游引物:5'-CTTCCTCTCCAAAATGCCAG-3'，下游引物:5'-AGAGATGGAAGGGGGAAAGA-3'，片段長度550 bp。

Rb上游引物:5'-CAGACTGATTCTATAGACAG-3'，下游引物:5'-GTTTGTATCGCTGTGATCC-3'，片段長度327 bp。

P16上游引物:5'-CCTGGCTCTGACCATTCTGT-3'，下游引物:5'-GTCCTCACCTGAGGGACCTT-3'，片段長度347 bp。

GAPDH上游引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTG-3'，片段長度452 bp。

1.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 采用MTT法進(jìn)行檢測，具體如下:以104個細(xì)胞/孔的密度將視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞SORB50接種于96孔板，藥物處理組分別加入6.25、12.5、25、50、100 μmol/L白藜蘆醇，對照組加0.5%DMSO，每組6個復(fù)孔。分別孵育24 h和48 h，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束之前4 h，每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)孵育4h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，離心棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，于室溫輕微溶解結(jié)晶15 min，用酶標(biāo)儀測定吸光度OD490值。

1.3 細(xì)胞周期分析 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO-RB50細(xì)胞分別加入6.25、12.5、25、50、100 μmol/L 白藜蘆醇孵育48 h，經(jīng)胰酶消化后收集細(xì)胞并在細(xì)胞中加入1 mL 70%的乙醇，混勻，上Becton Dickinsor FACscan流式細(xì)胞儀檢測 SORB50細(xì)胞周期分布情況。

1.4 RT-PCR檢測 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO-RB50細(xì)胞加入50 μmol/L白藜蘆醇，對照組加入等體積0.5%DMSO孵育24 h后收集細(xì)胞，按照Trizol試劑說明書，采用一步法提取各組細(xì)胞總RNA。在測定完總RNA濃度和純度后，取等量RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。之后在Taq酶的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的片段。PCR參數(shù)設(shè)置為預(yù)變性95℃ 5 min，然后95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 30 s，在完成25個循環(huán)后，72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(80 V 1 h)分離，結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描及密度分析。以GAPDH條帶作為內(nèi)參照，以目的片段條帶密度值/GAPDH條帶密度值的比值進(jìn)行分析。

1.5 Western blot分析 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO-RB50細(xì)胞加入50 μmol/L白藜蘆醇，對照組加入等體積0.5%DMSO孵育48 h后收集細(xì)胞，加入冰的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，定量完畢，實(shí)驗(yàn)組和對照組均取60 μg蛋白樣品煮沸變性后，進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳。根據(jù)蛋白marker的指示，將含有目的條帶的凝膠轉(zhuǎn)到PVDF膜上，依次進(jìn)行:5%脫脂奶粉室溫1 h;相應(yīng)一抗4℃過夜;TBST漂洗3次后加相應(yīng)二抗37℃ 1.5 h;TBST漂洗3次后，ECL發(fā)光法顯色;最后對條帶進(jìn)行吸光度積分掃描。以GAPDH條帶作為內(nèi)參照，以目的片段條帶密度值/GAPDH條帶密度值的比值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖活性的影響 MTT分析檢測結(jié)果表明，在 6.25、12.5、25、50 μmol/L濃度范圍內(nèi)的白藜蘆醇作用24h及48h，均能抑制SO-RB50細(xì)胞增殖，且抑制效應(yīng)與白藜蘆醇作用濃度呈依賴關(guān)系。其中50 μmol/L白藜蘆醇處理視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞48 h時抑制作用已較為明顯，而100 μmol/L濃度并不能使抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng) (均P＜0.05)。見表1。

表1 白藜蘆醇對人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO-RB50細(xì)胞OD值的影響(%，±s，n=6)

表1 白藜蘆醇對人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO-RB50細(xì)胞OD值的影響(%，±s，n=6)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

劑量/(μmol·L-1)24 h 48 h對照組1.58 ±0.39 1.67 ±0.386.25 1.16 ±0.31 1.12 ±0.29*12.5 1.01 ±0.29* 0.93 ±0.36＊＊25 0.97 ±0.23＊＊ 0.89 ±0.25＊＊50 0.84 ±0.26＊＊ 0.76 ±0.26＊＊100 0.86 ±0.15＊＊ 0.79 ±0.24＊＊

2.2 細(xì)胞周期分析 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，12.5、25、50、100 μmol/L白藜蘆醇處理后，SO-RB50細(xì)胞周期分布發(fā)生了改變，即處于 G1期的SO-RB50細(xì)胞數(shù)明顯增加(P＜0.05，P＜0.01)，處于S期的SO-RB50細(xì)胞數(shù)顯著減少 (P＜0.05，P ＜0.01)。見表2。

2.3 對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA表達(dá)的影響 RT-RCR結(jié)果顯示，50 μmol/L白藜蘆醇作用視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞48 h后，視網(wǎng)膜母細(xì)胞PCNA和Cyclin D mRNA表達(dá)水平顯著下降 (P＜0.01)，抑癌基因Rb和 P16 mRNA水平顯著上升 (P＜0.01)。見表3，圖1。

表2 白藜蘆醇作用對SO-RB50細(xì)胞周期分布的影響(±s，n=6)

表2 白藜蘆醇作用對SO-RB50細(xì)胞周期分布的影響(±s，n=6)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

劑量/(μmol·L-1) G1期/% S期% G2/M期/%對照組12.2 ±5.656.7 ±7.8 26.8 ±5.2 16.5 ±4.66.25 62.9 ±8.2 22.5 ±6.5 14.6 ±4.512.5 68.4 ±9.8* 19.2 ±3.5* 12.4 ±3.625 76.1 ±10.1＊＊ 11.6 ±3.3＊＊ 12.3 ±4.750 78.8 ±11.9＊＊ 10.1 ±2.8＊＊ 11.1 ±5.4100 77.3 ±9.9＊＊ 10.5 ±3.1＊＊

表3 白藜蘆醇對SO-RB50細(xì)胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA表達(dá)的影響(±s，n=6)

表3 白藜蘆醇對SO-RB50細(xì)胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA表達(dá)的影響(±s，n=6)

注:與對照組比較，＊＊P ＜0.01。

mRNA PCNA Cyclin D Rb P16對照組組別1.38 ±0.34 0.83 ±0.19 0.09 ±0.02 0.29 ±0.07白藜蘆醇組 0.43 ±0.08＊＊0.38 ±0.08＊＊0.60 ±0.13＊＊ 1.02 ±0.28＊＊

圖1 PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA的表達(dá)情況(RT-PCR)

2.4 對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞 PCNA、Cyclin D、Rb和P16蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，50 μmol/L白藜蘆醇處理視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞48 h后，PCNA和Cyclin D蛋白水平顯著下降 (P＜0.01)，抑癌基因Rb和P16蛋白水平顯著上升 (P＜0.01)。見表4，圖2。

表4 白藜蘆醇對SO-RB50細(xì)胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16蛋白表達(dá)的影響(±s，n=6)

表4 白藜蘆醇對SO-RB50細(xì)胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16蛋白表達(dá)的影響(±s，n=6)

注:與對照組比較，＊＊P ＜0.01。

PCNA Cyclin D Rb P16對照組組別 蛋白0.96 ±0.25 0.95 ±0.17 0.33 ±0.04 0.30 ±0.06白藜蘆醇組 0.38 ±0.05＊＊0.51 ±0.06＊＊0.87 ±0.14＊＊ 0.78 ±0.13＊＊

3 討論

圖2 PCNA、Cyclin D、Rb和P16蛋白的表達(dá)情況(Western blot)

由于放化療等措施對于機(jī)體的副作用大，且在許多惡性腫瘤的治療中治療效果有限，故近年來中藥提純物作為惡性腫瘤輔助治療藥物受到了越來越多的關(guān)注，且研究已取得許多成果［3-4］。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 (retinoblastoma，RB)是嬰幼兒最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，其發(fā)生主要是由于Rb基因的缺失或失活導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常所致。RB生長迅速、惡性度高、轉(zhuǎn)移早，嚴(yán)重危害患兒的視力及生命。有研究表明，白藜蘆醇可明顯抑制不同癌細(xì)胞增殖，但是，筆者未見到關(guān)于白藜蘆醇是否影響人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，6.25～100 μmol/L范圍內(nèi)白藜蘆醇均能顯著抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，且抑制效應(yīng)與白藜蘆醇的作用時間呈依賴關(guān)系。隨后進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)以明確白藜蘆醇對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期的具體影響，結(jié)果顯示，不同濃度的白藜蘆醇作用后，處于G1期的SORB50細(xì)胞數(shù)明顯增加，處于S期的SO-RB50細(xì)胞數(shù)顯著減少，且50 μmol/L白藜蘆醇作用48 h時變化最明顯，提示白藜蘆醇具有明顯的抗人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的作用，這一作用是白藜蘆醇通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的。

本研究為探討白藜蘆醇抑制人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖的機(jī)制，檢測了與細(xì)胞周期密切相關(guān)的蛋白，這些調(diào)節(jié)因子的表達(dá)失衡可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。其中，PCNA能夠反映細(xì)胞增殖分?jǐn)?shù)和所處周期的客觀指標(biāo)，也可以作為判定腫瘤的惡性程度及預(yù)后的重要指標(biāo)［5］;CyclinD1是細(xì)胞周期重要的正調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的促進(jìn)作用［6］，若CyclinD1基因發(fā)生改變，則有可能導(dǎo)致細(xì)胞周期的異常調(diào)控，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化甚至癌變［7］。我們的結(jié)果顯示用藥前SO-RB50細(xì)胞呈現(xiàn)PCNA、Cyclin D高表達(dá)，應(yīng)用白藜蘆醇后PCNA、Cyclin D表達(dá)均下調(diào)，結(jié)合FCM所測得的細(xì)胞周期結(jié)果，表明白藜蘆醇是通過下調(diào)PCNA、Cyclin D發(fā)揮抗腫瘤的作用。

臨床中視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生是一個涉及多重基因事件的復(fù)雜過程，僅一種癌基因缺失或突變不足以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，而是多個激活的癌基因與失活的抑癌基因之間的協(xié)同作用的結(jié)果，因此我們進(jìn)一步研究了白藜蘆醇對抑制癌基因的作用。Rb和P16均是重要的抑制癌基因。Rb對細(xì)胞周期的調(diào)控作用主要是通過和E2F結(jié)合，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，使細(xì)胞周期停滯［8-9］。P16基因是近年研究發(fā)現(xiàn)的多種腫瘤抑制基因，作為細(xì)胞周期素依賴性激酶 (CDK)的抑制蛋白，與細(xì)胞周期蛋白共同推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，它的失活或缺失，會導(dǎo)致CDK過度作用，造成細(xì)胞非正常增殖［10］。我們的研究表明白藜蘆醇作用后抑癌基因Rb和P16 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下降，結(jié)合細(xì)胞周期相關(guān)因子PCNA、Cyclin D的結(jié)果進(jìn)行綜合分析，我們認(rèn)為白藜蘆醇可體外抑制SO-RB50增殖，其抑制作用是通過抑制PCNA和Cyclin D轉(zhuǎn)錄和翻譯、促進(jìn)Rb和P16轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程實(shí)現(xiàn)的。但闡明白藜蘆醇抗SO-RB50腫瘤活性機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

［1］Juhasz B，Mukherjee S，Das D K.Hormetic response of resveratrol against cardioprotection［J］.Exp Clin Cardiol，2010，15(4):e134-e138.

［2］Bereswill S，Mu?oz M，F(xiàn)ischer A，et al.Anti-inflammatory effects of resveratrol，curcumin and simvastatin in acute small intestinal inflammation［J］.PLos One，2010，5(12):e15099.

［3］劉翠霞，周 坤，王亞珍，等.康萊特對人肺腺癌細(xì)胞A549增殖活性影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22(6):1437-1438.

［4］張振軍，劉 錚，萬良剛.姜黃素對人卵巢癌SK細(xì)胞增殖活性及PCNA、P53mRNA表達(dá)的影響［J］.疑難病雜志，2009，8(8):468-470.

［5］Maffia P，Grassia G，Di Meglio P，et al.Neutralization of interleukin-18 inhibits neointimal formation in a rat model of vascular injury［J］.Circulation，2006，114(5):430-437.

［6］Moghaddam S J，Haghighi E N，Samiee S，et al.Immunohistochemical analysis of p53，cyclinD1，RB1，c-fos and N-ras gene expression in hepatocellular carcinoma in Iran［J］.World J Gastroenterol，2007，13(4):588-593.

［7］Le Marchand L，Seifried A，Lum-Jones A，et al.Association of the cyclin D1 A870G polymorphism with advanced colorectal cancer［J］.JAMA，2003，290(21):2843-2848.

［8］Ewen M E，Xing Y G，Lawrence J B，et al.Molecular cloning，chromosomal mapping，and expression of the cDNA for p107，a retinoblastoma gene product-related protein［J］.Cell，1991，66(6):1155-1164.

［9］Du W，Pogoriler J.Retinoblastoma family genes［J］.Oncogene，2006，25(38):5190-5200.

［10］Okamoto A，Demetrick D J，Spillare E A，et al.Mutations and altered expression of p16INK4 in human cancer［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91(23):11045-11049.