李麗敏， 夏 晶， 王欣美， 王枚博， 王 柯， 季 申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203)

礦物藥雄黃主要成分是四硫化四砷 (As4S4)和硫化砷 (AsS)，此外雄黃中還含有少量的As2O3或As2O［1］5。砷為劇毒元素，國(guó)際上對(duì)其有嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)［2-3］，故雄黃安全性受到質(zhì)疑。然而許多含雄黃傳統(tǒng)中藥對(duì)一些疑難雜癥有特殊療效，近年國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)含雄黃的復(fù)方制劑或單方對(duì)于治療血液系統(tǒng)疾病、惡性淋巴系統(tǒng)疾病甚至實(shí)體瘤有著顯著效果［4-6］，雄黃中砷雖然有毒性但也可能是治療的有效成分。許多研究者對(duì)含雄黃中藥用量與毒性展開討論［7-8］，其焦點(diǎn)是該類制劑中雄黃所含砷引發(fā)的毒性問題;研究結(jié)果表明，含雄黃中藥制劑經(jīng)口服后，其所含的砷并非全部被人體吸收［9］，說明雄黃中所含有的大量不被機(jī)體所吸收的砷是無效或無毒成分。

砷元素作用于人體，其活性和毒性與其存在形態(tài)密切相關(guān)。雄黃中主成分砷進(jìn)入機(jī)體后會(huì)發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，經(jīng)酶催化通過氧化還原、生物甲基化、生物合成等過程會(huì)產(chǎn)生多種砷的形態(tài)，其在體內(nèi)的存在形態(tài)主要包括四類:無機(jī)砷 (亞砷酸鹽和砷酸鹽)、有機(jī)砷小分子 (甲基砷酸、二甲基砷酸)、砷的有機(jī)化合物(砷甜菜堿、砷膽堿、乳酸三甲基砷、砷酯及砷糖等)、含砷的生物大分子 (不同價(jià)態(tài)的砷化物與轉(zhuǎn)鐵白蛋白或血紅蛋白的結(jié)合物)［10］。其中亞砷酸 (As3+)比砷酸 (As5+)更容易與蛋白質(zhì)中的巰基結(jié)合，所以毒性最大，一甲基砷酸 (MMA)和二甲基砷酸 (DMA)只具有中等毒性，而動(dòng)植物中的砷甜菜堿和砷膽堿幾乎無毒性［11］。以總砷為標(biāo)準(zhǔn)，該類中藥砷含有量將大大高于限量，是不客觀和不合理的。

國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)于含雄黃中藥可溶性砷總量或其形態(tài)研究逐漸增多［12-14］，多采用模擬體內(nèi)仿生提取法研究人工胃液或人工腸液中可溶性砷及其形態(tài);但對(duì)采用其他提取溶劑進(jìn)行含雄黃中藥可溶性砷的研究尚未見報(bào)道。含雄黃中藥成分復(fù)雜，同一處方中其他中藥材不僅會(huì)影響雄黃中砷在體內(nèi)的溶出，而且可能會(huì)對(duì)其中砷的價(jià)態(tài)產(chǎn)生影響，也可能會(huì)形成砷絡(luò)合物;本實(shí)驗(yàn)旨在通過不同提取溶劑和提取方法的研究，采用高效液相色譜 (HPLC)-電感耦合等離子體質(zhì)譜 (ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)、快速分析6種砷形態(tài)，研究探討不同提取溶劑中藥雄黃及5種不同含雄黃復(fù)方制劑中可溶性砷含有量及其形態(tài)分布，為含雄黃中藥的標(biāo)準(zhǔn)及其限量制訂研究奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器 美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀(HPLC);美國(guó)Agilent 7500Ce電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 (ICP-MS);美國(guó) Millipore超純水機(jī)(Milli-Q);Dionex公司的ASE100型快速溶劑萃取儀;美國(guó)CEM微波消解儀。

1.2 試劑及試藥

1.2.1 試劑 磷酸二氫銨、EDTA均為分析純;超純水:電阻率18.2 MΩ/cm;鹽酸、硝酸、甲醇均購(gòu)于德國(guó) Merck 公司;7Li、89Y、140Ce、205Tl調(diào)諧液購(gòu)于美國(guó)Agilent公司。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液 砷標(biāo)準(zhǔn)溶液 (1.00 g/L)、亞砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) ［(As(Ⅲ)，μmol/g)］、砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［(As(Ⅴ)，0.233 μmol/g)］、一甲基砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) (MMA，二甲基砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) (DMA，CH3CH2AsO2=0.706 μmol/g)、砷膽堿溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) (AsC，C5H14AsBrO=0.374 μmol/g)、砷甜菜堿溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) (AsB，C5H11AsO2=0.518 μmol/g)購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 茶葉 (地礦部物化探研究所，GBW10016(GSB-7);金槍魚 (TUNA FISH TISSUE，BCR-627，Institute for Reference Materials and Measurements)，海 藻 (Seaweed，T07129， The Food and Encironment Research Agency)。

1.2.4 試藥 雄黃藥材 (Y1);雄黃炮制品 (水飛)(Y2);七味新消丸 (Y3)、萬靈片 (Y4)、牛黃醒消丸 (Y5)、牛黃抱龍片 (Y6)和牛黃消炎片 (Y7)由上海雷允上藥業(yè)有限公司提供。除雄黃和水飛雄黃外，將其余樣品均研細(xì)后過九號(hào)篩。

2 方法與結(jié)果

2.1 ICP-MS及HPLC-ICP-MS測(cè)定條件 以10 μg/L 的7Li、89Y、140Ce、205Tl調(diào)諧液對(duì) ICP-MS 進(jìn)行調(diào)諧，使89Y靈敏度達(dá)到最優(yōu)，同時(shí)使75As有較高靈敏度和較低檢測(cè)限;ICP-MS儀器參數(shù):射頻功率1450 W，射頻電壓1.79 V，載氣體積流量1.10 L/min，蠕動(dòng)泵流速0.1 r/s，氦反應(yīng)碰撞模式，測(cè)定砷總量選擇全定量模式;HPLC-ICP-MS工作條件:采用Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)陰離子交換色譜柱，以 50 mmol/L NH4H2PO4(pH 8.0)為流動(dòng)相，ICP-MS選擇時(shí)間分辨模式，其他條件同ICP-MS儀器參數(shù)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備及線性關(guān)系考察

2.2.1 砷標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備及線性關(guān)系考察 精密吸取砷標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用稀釋液 (含1%鹽酸、2%硝酸和1%甲醇的混合溶液)制成每1 L含砷0、1、5、20、50、100、250 μg的系列溶液，作為測(cè)定砷總量和可溶性砷總量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0～250 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，砷元素線性方程為:A=4.010×10－3C+1.021 ×10－4(相關(guān)系數(shù) R=0.9996)，線性關(guān)系良好。

2.2.2 砷價(jià)態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備及線性關(guān)系考察精密吸取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsC和AsB標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液適量，用0.05 mol/L EDTA溶液制成每 1 L含 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA、AsC和 AsB等不同價(jià)態(tài)砷 0、5、10、20、50、100、200 μg的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以各待測(cè)峰峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種價(jià)態(tài)的砷在擬訂色譜條件下分離較好 (見圖1)，在0～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 (見表1)。

圖1 砷的6種形態(tài)分析色譜圖Fig.1 Chromatogram for six speciations of arsenic

表1 6種不同價(jià)態(tài)砷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Tab.1 Equation of the six different arsenic speciations

2.3 總砷含有量測(cè)定 精密稱取雄黃及水飛雄黃0.05 g、含雄黃中藥0.3～0.5 g于微波消解罐中，加入5 mL消解液 (硝酸∶鹽酸3∶1)，放置30 min后，將密封罐置于微波消解儀中按既定程序進(jìn)行消解，若消解不完全則再加入1 mL消解液，繼續(xù)消解至罐內(nèi)溶液澄清為止。將消解后樣品轉(zhuǎn)移至50 mL聚四氟乙烯量瓶中，定容至刻度，樣品溶液以稀釋液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，采用ICP-MS測(cè)定砷總量。

2.3.1 準(zhǔn)確度與精密度 取茶葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.5 g，按照供試品溶液制備方法制備，以既定方法用ICP-MS測(cè)定砷總量，一式6份平均測(cè)定結(jié)果為0.082 mg/kg，RSD為7.8%;測(cè)定結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi) (0.09±0.01)mg/kg，說明測(cè)定方法準(zhǔn)確度高，精密度好。

2.3.2 樣品中總砷含有量 7種雄黃及其復(fù)方制劑中總砷的定量分析結(jié)果見表2。由表2可見，若以總砷計(jì)則均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出《中國(guó)藥典》2010年版一部中規(guī)定的中藥材允許限量值2 mg/kg。

表2 總砷測(cè)定結(jié)果Tab.2 Result of total arsenic in samples

2.4 可溶性砷提取方法 精密稱取雄黃及水飛雄黃0.1 g、含雄黃中藥0.5 g，分別用以下方法進(jìn)行提取。

2.4.1 快速溶劑萃取 (ASE) 精密稱取樣品于不銹鋼萃取池中。萃取程序如下:萃取時(shí)間為平衡5 min，重復(fù)2次;萃取溫度為100℃;萃取溶劑為甲醇/水 (V/V，1∶1);萃取壓力為1500 psi(1 psi=6.895 kPa)。萃取液在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，殘?jiān)贸兯芙?，恒定質(zhì)量至10 g，即得。

2.4.2 甲醇超聲提取 精密稱取樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL甲醇－水 (V/V，1∶1)冰浴超聲60 min，然后置于離心機(jī)中以5000 r/min旋轉(zhuǎn)30 min，精密吸取上清液5 mL，在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，殘?jiān)贸兯芙猓ㄙ|(zhì)量至10 g，即得。

2.4.3 0.16%鹽酸超聲提取 精密稱取樣品于50 mL具塞離心管中，精密加入10 mL 1%鹽酸(V/V)溶液，混勻，冰浴超聲60 min，然后置于離心機(jī)中以5000 r/min旋轉(zhuǎn)30 min，取上清液即得。

2.4.4 模擬人工胃液振蕩提取 精密稱取樣品于50 mL具塞離心管中，精密加入10 mL人工胃液，混勻，置于搖床上，控制溫度37℃，振搖4 h。冷卻，然后置于離心機(jī)中以5000 r/min旋轉(zhuǎn)30 min，取上清液即得。

以上樣品溶液均過0.22 μm的濾膜，取續(xù)濾液按砷形態(tài)分析方法測(cè)定不同提取條件下可溶性砷形態(tài);樣品溶液經(jīng)稀釋液稀釋后，按照砷總量測(cè)定條件測(cè)定不同提取條件下可溶性砷總量。

2.5 可溶性砷準(zhǔn)確度及精密度 取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)金槍魚0.5 g含砷甜菜堿 (3.9±0.225)mg/kg，二甲基砷 (0.15±0.0225)mg/kg，及海藻0.1 g含無機(jī)砷 ［As(Ⅲ)和As(Ⅴ)］86～118 mg/kg。按照可溶性砷的提取方法提取，分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中有機(jī)砷和無機(jī)砷的價(jià)態(tài)，各一式6份，用以可溶性砷準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)。結(jié)果見表3，表4。

結(jié)果表明，不同提取方法的有機(jī)砷 (金槍魚)和無機(jī)砷 (海藻)提取結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi); 方法重復(fù)性RSD均小于10%。

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)金槍魚中有機(jī)砷價(jià)態(tài)的準(zhǔn)確度及精密度試驗(yàn)Tab.3 Accuracy and reproducibility of the organic arsenic in standard substance(tuna fish)

表4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)海藻中不同價(jià)態(tài)砷準(zhǔn)確度及精密度試驗(yàn)Tab.4 Accuracy and reproducibility of the inorganic arsenic in standard substance(Seawead)

2.6 可溶性砷總量及形態(tài)的測(cè)定

2.6.1 可溶性砷總量 將2.4.1項(xiàng)～2.4.4項(xiàng)的樣品溶液經(jīng)一定比例稀釋后，按照砷總量測(cè)定條件采用ICP-MS測(cè)可溶性砷總量，結(jié)果見表5。將不同提取方法的可溶性砷總量與各樣品中所含總砷量進(jìn)行比較 (見表6)，結(jié)果表明可溶性砷的量?jī)H占總砷量的0.10%～2.70%。

表5 可溶性砷總量結(jié)果Tab.5 Results of total soluble arsenic

表6 可溶性砷總量與總砷含有量百分比Tab.6 Total soluble arsenic in the percentage of the total arsenic

2.6.2 可溶性砷的形態(tài)分析 將2.4.1項(xiàng)～2.4.4項(xiàng)的樣品溶液按照既定條件進(jìn)行測(cè)定，考察不同提取溶劑提取出可溶性砷的形態(tài) (見圖1～2)。將測(cè)得的形態(tài)含量總和與各樣品總砷量及可溶性砷總量進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同方法提取出的砷價(jià)態(tài)均僅有三價(jià)砷 ［As(Ⅲ)］和五價(jià)砷 ［As(Ⅴ)］兩種價(jià)態(tài)，結(jié)果見表7～8。

圖2 樣品中可溶性砷形態(tài)分析色譜圖Fig.2 Chromatogram for the speciation of the soluble arsenic in the sample

2.7 不同砷價(jià)態(tài)的檢測(cè)限 以5 μg/L的不同價(jià)態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)樣分析，計(jì)算各峰信噪比，并換算至3倍信噪比，作為不同砷價(jià)態(tài)的檢測(cè)限，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA、AsC、AsB的檢測(cè)限分別為 2.4、2.6、2.5、2.7、1.8、0.9 μg/L。

3 討論

3.1 可溶性砷不同提取溶劑和方法比較研究 砷形態(tài)分析中常用酸性溶劑提取毒性較大的無機(jī)砷，另外甲醇-水 (1∶1)也是常用的砷形態(tài)提取溶劑，該溶劑可提取砷的無機(jī)和有機(jī)形態(tài)［15］。含雄黃中藥口服后經(jīng)胃液消化再進(jìn)入體內(nèi)，因此許多學(xué)者應(yīng)用仿生手段模擬人工胃液提取可溶性砷，本課題除研究模擬人體條件下提取的可溶性砷外，還結(jié)合0.16%鹽酸溶液，甲醇-水 (1∶1)等不同提取溶劑采用水浴振蕩、超聲等不同提取方法，對(duì)含雄黃中藥中可溶性砷形態(tài)進(jìn)行全面研究，采用無機(jī)砷和有機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行方法學(xué)研究表明，方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

表7 可溶性砷的形態(tài)測(cè)定結(jié)果Tab.7 Results of the speciation of the soluble arsenic

表8 可溶性砷形態(tài)與總砷量、可溶性砷總量比較Tab.8 Comparison of total arsenic and total soluble arsenic with the speciation of the soluble arsenic

由表5結(jié)果可知采用人工胃液振蕩提取、0.16%鹽酸溶液超聲提取，其提出的可溶性砷量基本相當(dāng)，因此在模擬人體研究中采用超聲方法代替振蕩，顯著提高效率。選用甲醇-水 (1∶1)為溶劑進(jìn)行超聲及快速溶劑萃取結(jié)果發(fā)現(xiàn):雄黃及含雄黃中成藥經(jīng)酸液和甲醇提取后，均僅有As(Ⅲ)和As(Ⅴ)兩種價(jià)態(tài)，未發(fā)現(xiàn)含有砷膽堿、砷甜菜堿、一甲基砷和二甲基砷。As(Ⅲ)和As(Ⅴ)是毒性較大的兩種砷形態(tài)，但在中藥復(fù)方中也是起療效的兩種形態(tài)［14］，因此有必要對(duì)其進(jìn)行深入研究，擬訂適當(dāng)?shù)南蘖?，完善該類藥物的質(zhì)量控制，以保證用藥安全有效。

表5結(jié)果中雄黃和水飛雄黃可溶性砷的量相差約5倍，可能與雄黃經(jīng)水飛后其粒度非常細(xì)小，可溶性砷隨之增加;該現(xiàn)象與傳統(tǒng)觀念認(rèn)為水飛工藝是減少可溶性砷的觀念有較大差異，但與目前通過減小雄黃粒度采用新型納米雄黃制劑治療血液系統(tǒng)疾病的原理一致［16］，說明雄黃經(jīng)水飛的目的并非降低其可溶性砷的量，本課題組的相關(guān)研究表明雄黃經(jīng)水飛后，其伴生元素如鉛、鐵等含量大大降低，可能是雄黃經(jīng)炮制后降低毒性的原因之一。

3.2 不同制劑中雄黃可溶性砷形態(tài)比較 模擬人體環(huán)境提取可溶性砷中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)之和與可溶性砷總量結(jié)果比較顯示，雄黃藥材及其炮制品中兩者接近，但在含雄黃中成藥兩者因品種不同而差別較大，有些制劑中檢測(cè)到As(Ⅲ)和As(Ⅴ)之和僅為可溶性砷總量的53.98%(見表8)，說明雄黃單獨(dú)口服在體內(nèi)溶出的只有As(Ⅲ)和As(Ⅴ)，雄黃的復(fù)方制劑中其他成分使溶出的砷形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)化，但并未形成目前已知6種價(jià)態(tài)的砷，推測(cè)形成其他砷大分子復(fù)合物，這類砷復(fù)合物是否能被人體吸收或者可降低其對(duì)人體的毒性，有待進(jìn)一步深入研究。

表8中采用有機(jī)溶劑甲醇-水提取的可溶性砷As(Ⅲ)和As(Ⅴ)均高于模擬體內(nèi)結(jié)果，推測(cè)有機(jī)溶劑提取過程一些有機(jī)價(jià)態(tài)的砷或砷復(fù)合物被提取，而后轉(zhuǎn)化為As(Ⅲ)或As(Ⅴ)，具體轉(zhuǎn)化如何發(fā)生還有待進(jìn)一步研究。

3.3 含雄黃制劑可溶性砷限量探討 雄黃及其中藥復(fù)方制劑中砷的總量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了國(guó)際上規(guī)定的人日攝入砷量的標(biāo)準(zhǔn)，但采用人工胃液提取的酸可溶性砷僅為其總量的0.13%～2.7%，表9根據(jù)各樣品服用量并結(jié)合其處方量及上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算酸可溶性砷日攝入量。結(jié)果表明，大多數(shù)樣品酸可溶性總砷的攝入量小于食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)的安全限量 (0.128 mg/(人·d－1)，但也有3個(gè)樣品超出該限量，其酸可溶性砷中As(Ⅲ)+As(Ⅴ)的日攝入量小于酸可溶性總砷日攝入量。

表9 雄黃及其成方制劑中日攝入最大酸可溶性砷量Tab.9 Daily intake of the realgar and its preparations

酸可溶性砷及其形態(tài)日攝入量超出安全限量并不能說明其毒性大，本課題組對(duì)雄黃大鼠體內(nèi)代謝初步研究結(jié)果顯示，砷進(jìn)入體內(nèi)大多數(shù)會(huì)排泄出體外，另外一部分經(jīng)人體吸收的砷經(jīng)體內(nèi)酶作用均轉(zhuǎn)化為毒性較小的一甲基砷，因此對(duì)于含雄黃中藥可溶性砷限量應(yīng)根據(jù)具體品種結(jié)合體內(nèi)毒性試驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

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