吳青青， 陳 彥， 蔡 垠， 賈曉斌

(江蘇省中醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，江蘇南京210028)

組分配伍中藥中有效組分的生物藥劑學(xué)特性是影響創(chuàng)新中藥口服吸收及其生物利用度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1-2］。而以往創(chuàng)新中藥的研發(fā)較重視活性組分的提取純化及制劑工藝成型等過程，較少關(guān)注提取物的生物藥劑學(xué)特性?！皬?fù)方羊藿三七片”收載于國家藥品標準，由藥材淫羊藿和三七組成，具有溫陽通脈，化瘀止痛之功效［3］，但其活性組分的生物藥劑學(xué)特性不詳，影響了其深度開發(fā)與療效的發(fā)揮。因此本研究選擇羊藿三七復(fù)方為模型藥物，采用Caco-2細胞模型，考察羊藿三七提取物中主成分淫羊藿苷的腸吸收轉(zhuǎn)運情況并與淫羊藿提取物及單體淫羊藿苷比較，為中藥組分尤其是難溶性組分與低膜滲透性組分的適宜劑型的設(shè)計提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Caco-2 TC7細胞株 (由法國 Moniqué Rousset博士饋贈);非必需氨基酸 (JRH公司);谷氨酰胺、胰蛋白酶 (Sigma公司);胎牛血清 (Equitech-Bio，INC公司);DMEM培養(yǎng)基 (Hyclone公司);淫羊藿苷 (批號110737-200312，供定量測定用)購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

三七藥材購于同濟藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地:云南;淫羊藿藥材，購自吉林敦化，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳德康教授鑒定分別為朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai和三七Panax notoginseng。

二氧化碳培養(yǎng)箱 (Nuaire，美國);XDS—1B倒置顯微鏡 (重慶);高速冷凍離心機 (Allergra X-22R，Beckman， 美 國);Transwell培 養(yǎng) 板(NUNC，丹麥);Millicell—ERS跨膜電阻儀 (Millipore，美國);Agilent 1200型高效液相色譜儀(Agilent，美國);Milli—Q純水機 (Millipore，美國)。

1.1 羊藿三七提取物及淫羊藿提取物的制備 羊藿三七提取物制備:稱取處方量淫羊藿600 g，加水煎煮2次，第1次2 h，第2次1 h，合并煎液，濾過;稱取三七粗粉200 g，加水煎煮3次，第1次3 h，第2次2 h，第3次1 h，合并煎液，濾過，濾液與淫羊藿濾液合并，減壓濃縮成相對密度為1.30～1.35(80～85℃)的稠膏，干燥即得羊藿三七提取物。

淫羊藿提取物制備:稱取淫羊藿600 g，加水煎煮2次，第1次2 h，第2次1 h，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮 (80～85℃)成稠膏，干燥即得淫羊藿提取物。

1.2 不同樣品淫羊藿苷的跨膜轉(zhuǎn)運實驗

1.2.1 樣品溶液的配制 淫羊藿苷溶液配制:精密稱取淫羊藿苷3.38 mg，將其溶解于500 μL DMSO-無水乙醇溶液中，精密吸取該溶液100 μL置50 mL量瓶中，用 Hank's平衡鹽溶液 (HBSS溶液)溶解定容，配制成含淫羊藿苷 20 μmol/L的溶液。

羊藿三七提取物溶液配制:精密稱取羊藿三七提取物132.0 mg，按“淫羊藿苷溶液配制”方法，將其配制成含淫羊藿苷20 μmol/L的溶液。

淫羊藿提取物溶液配制:精密稱取淫羊藿提取物101.3 mg，按“淫羊藿苷溶液配制”方法，將其配制成含淫羊藿苷20 μmol/L的溶液。

睪丸酮內(nèi)標溶液配制:精密稱取睪丸酮14.4 mg，加乙腈溶解定容至5 mL，配制成質(zhì)量濃度為10 μmol/L的貯備液。精密吸取該貯備液0.1 mL，加入9.4 mL乙腈與0.6 mL冰乙酸，混合均勻，即得含睪丸酮100 μmol/L的內(nèi)標溶液。

1.2.2 轉(zhuǎn)運實驗［4-5］Caco-2細胞培養(yǎng)于 DMEM培養(yǎng)液，其中含10%胎牛血清，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺和青霉素 (100 U/mL)-鏈霉素(100 μg/mL)雙抗液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)19～21 d可用于實驗。

轉(zhuǎn)運實驗前，先用37℃ pH 7.4的HBSS溶液將細胞單層洗滌3次，檢測各孔跨膜電阻值大于100 Ω/4.2 cm2以上，方可用于實驗。將已配置的藥物溶液分別加在細胞絨毛面頂側(cè) (AP側(cè))或基底面?zhèn)?(BL側(cè))，相對應(yīng)的BL側(cè)或AP側(cè)加入空白HBSS溶液，體積分別為2 mL。將加完藥和空白HBSS溶液的培養(yǎng)板置于恒溫搖床中 (50 r/min，37℃)，分別在1，2，3、4 h在細胞供給池或接收池取樣400 μL，同時在細胞供給或接收側(cè)補充等體積的藥物溶液或HBSS溶液。試驗平行做3份。

1.2.3 樣品處理 將所取樣品立刻加入100 μL的睪丸酮 (100 μmol/L)內(nèi)標溶液，13000 r/min離心15 min，按照HPLC分析方法進行檢測。

1.2.4 高效液相樣品分析 ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相為乙腈-水，梯度洗脫:0～15 min，乙腈10% ～25%;15～38 min，乙腈25%;38～61 min，乙腈25% ～71%;61～70 min，乙腈71%;體積流量1 mL/min，檢測波長268 nm;柱溫為30℃。HPLC圖譜見圖1。

圖1 淫羊藿苷 (A)、淫羊藿提取物 (B)和羊藿三七提取物 (C)Caco-2細胞實驗轉(zhuǎn)運4 h HPLC圖(BL-AP)Fig.1 HPLC chromatography of 4h Caco-2 cell transport sample(BL-AP)of icariin(A)，extract of Epimedii Herba(B)and extract of Yanghuo Sanqi Tablats(C)

1.2.5 數(shù)據(jù)分析［6］藥物透過Caco-2細胞單層的能力以表觀滲透系數(shù)Papp值為考察指標，其計算公式:Papp=(dQ/dt)/SC

其中dQ/dt為接收池待測藥物濃度變化的表觀線性速率，S為Caco-2細胞膜表面積 (4.2 cm2)，C為藥物的初始濃度。用Excel表對實驗數(shù)據(jù)進行計算分析。

2 結(jié)果

20 μmol/L淫羊藿苷及含有20 μmol/L淫羊藿苷的復(fù)方羊藿三七提取物及淫羊藿提取物通過Caco-2細胞單層轉(zhuǎn)運的滲透系數(shù)測定結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明，在淫羊藿苷濃度相同的條件下，羊藿三七提取物及淫羊藿提取物中淫羊藿苷的吸收滲透系數(shù)均較小，且略小于單體，但無顯著性差異，而分泌滲透系數(shù)與單體相比較均有顯著性降低的趨勢，整體外排比率下降了1倍左右。各樣品中淫羊藿苷的雙向轉(zhuǎn)運量隨時間的變化見圖2。實驗結(jié)果表明，各樣品中淫羊藿苷雙向轉(zhuǎn)運量在4 h內(nèi)都隨著時間的增加而呈線性增長趨勢。

表1 淫羊藿苷表觀滲透系數(shù)測定結(jié)果(±s，n=3)Tab.1 The Pappof icariin(±s，n=3)

表1 淫羊藿苷表觀滲透系數(shù)測定結(jié)果(±s，n=3)Tab.1 The Pappof icariin(±s，n=3)

注:與淫羊藿單體比較，*P＜0.05。

樣 品Papp/(×10－6cm·s－1)AP-BL BL-AP PBA/PAB羊藿三七提取物 0.52±0.034 1.28±0.043*2.46淫羊藿提取物 0.55±0.014 1.26±0.012* 2.29單體淫羊藿苷0.62±0.032 3.00±0.22 4.83

圖2 淫羊藿苷1～4 h跨膜轉(zhuǎn)運量Fig.2 Transport of icariin during 1－4 h

4 討論

本研究采用Caco-2細胞模型，考察了羊藿三七提取物中主成分淫羊藿苷的腸吸收轉(zhuǎn)運情況并與淫羊藿提取物及單體淫羊藿苷比較。課題組在前期研究中對單體淫羊藿苷的生物藥劑學(xué)特性如溶解性、膜滲透性、穩(wěn)定性、吸收代謝特性等進行了深入的研究［7-12］，結(jié)果表明單體淫羊藿苷吸收較差，其機制除與其單純的膜滲透性較差外，還可能存在著小腸上皮細胞中P-gp轉(zhuǎn)運蛋白的外排作用。對淫羊藿苷生物藥劑學(xué)特性的深入研究，有利于對以淫羊藿苷為主要活性成分的中藥劑型的設(shè)計提供科學(xué)依據(jù)。

中藥多以提取物或復(fù)方制劑應(yīng)用，但對中藥及復(fù)方提取物中活性成分或組分的生物藥劑學(xué)特性的研究目前還比較薄弱，中藥及復(fù)方提取物中活性成分由于與其它成分共存，其吸收代謝可能與單體化合物不同而更加復(fù)雜，因此不能以單體化合物的特性簡單替代提取物中的情況。本研究的實驗結(jié)果亦表明，羊藿三七提取物及淫羊藿提取物中所含淫羊藿苷的吸收滲透系數(shù)雖與淫羊藿苷單體相差較小，但分泌滲透系數(shù)卻顯著降低，外排比率降低了1倍左右，表明提取物中所含的其它成分可能對外排泵產(chǎn)生競爭抑制作用，抑制了淫羊藿苷的外排，從而有利于淫羊藿苷的吸收。由于羊藿三七提取物及淫羊藿提取物中淫羊藿苷的吸收滲透系數(shù)與分泌滲透系數(shù)相近，因此推測外排比率的下降主要與淫羊藿中所含的其它成分影響相關(guān)。然而，盡管淫羊藿中其他成分對淫羊藿苷具有促吸收作用，但與其它吸收較好的藥物相比，其本身的理化性質(zhì)仍然決定了其較差的胃腸道吸收特性。因此若以常規(guī)劑型制備以淫羊藿苷為主要成分的中藥或復(fù)方制劑，有可能因為淫羊藿苷較差的腸道吸收導(dǎo)致其生物利用度較低，不利于其藥理作用的發(fā)揮。因而在研制以淫羊藿為主藥的中藥制劑時，應(yīng)采用能促進淫羊藿苷等成分吸收的新劑型 (如微丸、納米制劑等)或添加促吸收的輔料 (如去氧膽酸鈉、維生素E-聚乙二醇-琥珀酸酯等)進一步促進吸收，從而提高生物利用度，充分發(fā)揮其藥理作用的目的。

對中藥及復(fù)方提取物中活性成分、組分生物藥劑學(xué)特性的深入了解，有利于將其設(shè)計成適宜的劑型，克服中藥活性成分、組分生物藥劑學(xué)特性的缺陷，提高其生物利用度，從而提高創(chuàng)新中藥的研制水平。

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