梁曾恩妮， 易有金， 郭雨桐， 王仁才， 熊興耀*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長沙410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128)

結(jié)腸癌是發(fā)生于結(jié)腸部位的常見消化道惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤的第3位，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。5-氟尿嘧啶對消化系統(tǒng)癌療效較好，是治療結(jié)腸癌的常見藥物，屬于劑量依賴型藥物。因此療效增加的同時藥物副作用也隨之增加，這已成為治療中的難題，限制了化療藥物的臨床應(yīng)用，降低了療效［1］。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性，其抗腫瘤作用備受關(guān)注［2-3］。研究證明中藥與化療藥物聯(lián)用不但可以減少藥物的不良反應(yīng)，還可使每藥發(fā)揮最大療效［4-5］，使臨床效果達(dá)到最佳。但靈芝多糖與抗癌化療藥物聯(lián)合應(yīng)用的研究很少［6］，尚未見靈芝多糖與化療藥物聯(lián)合作用于腫瘤細(xì)胞的報道。本實驗采用MTT法、聯(lián)合指數(shù)法、熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)研究靈芝多糖聯(lián)合5-氟尿嘧啶在體外對人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞生長、凋亡及細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo由武漢微生物研究所提供。靈芝多糖由國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實驗室提供。靈芝用熱水提取，脫蛋白、脫色素、葡聚糖凝膠Sephadex G-100和DEAE-纖維素層析柱分離純化，冷凍干燥得靈芝多糖粉。實驗前靈芝多糖和5-氟尿嘧啶用含10%血清的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解，混勻，過濾除菌，－4℃保存。

胎牛血清 (FBS)、DMEM(高糖)培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胰酶、碘化丙啶 (PI)(Beyotime公司);MTT(美國Sigma公司);5-氟尿嘧啶(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號:090807);二甲基亞砜 (DMSO)(北京Solarbio公司);6孔板和96孔板 (美國Conring公司)。

CO2培養(yǎng)箱2406-2(美國 Shellab公司);冷凍離心機(jī)CF16RXⅡ (日本日立公司);酶聯(lián)檢測儀mk3(美國 thermo公司);熒光倒置顯微鏡BX51(日本 Olympus公司);流式細(xì)胞儀 FC500(美國Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及試劑配制 LoVo細(xì)胞株生長于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，貼壁生長，于37℃恒溫、5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化并吹打分散均勻后使用。

2.2 細(xì)胞增殖抑制率的測定 采用MTT法［7］進(jìn)行。前期實驗測定了靈芝多糖 IC50值為2.33 mg/mL，后續(xù)實驗的靈芝多糖質(zhì)量濃度梯度設(shè)計以此為基礎(chǔ)，5-氟尿嘧啶的劑量設(shè)置參照文獻(xiàn) ［8］。將對數(shù)生長期密度為3×104個/mL的LoVo細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種100 μL。培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液，每孔加200 μL藥液。實驗共分5組，分別為靈芝多糖組 (終質(zhì)量濃度為0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)、5-氟尿嘧啶組 (終質(zhì)量濃度為25、50、100 μg/mL)、聯(lián)用組 (靈芝多糖終濃度為0.313、0.625、1.25和2.5 mg/L，5-氟尿嘧啶終質(zhì)量濃度為6.25、12.5、25和50 μg/mL，兩藥合用比例為1∶1方案)，另設(shè)對照組 (細(xì)胞、培養(yǎng)基和血清)和空白組 (培養(yǎng)基和血清)，每組5個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加MTT(5 mg/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸棄上清液，每孔加150 μL DMSO，輕輕震蕩10 min，用酶標(biāo)儀在492 nm處測定光密度 (A)值。按下式計算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率:腫瘤細(xì)胞生長抑制率 (inhibitory rate，IR)=(1－實驗組A492值/對照組A492值) ×100%。

2.3 藥物聯(lián)合作用評價 參照文獻(xiàn) ［9］，采用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法分析靈芝多糖和5-氟尿嘧啶之間相互作用效果。已知OD值求出藥物作用效應(yīng) (Fraction affected，fa)即抑制率，根據(jù)中效方程式fa/fu=(D/Dm)m，兩邊取對數(shù)lg(fa/fu)=mlgD－mlgDm。其中:fa為藥物作用效應(yīng);fu=1－fa，D為藥物質(zhì)量濃度;m為斜率;Dm為中效質(zhì)量濃度，即達(dá)到50%效應(yīng)時的藥物濃度。采用IC50計算軟件算出中效質(zhì)量濃度Dm(即IC50)，再計算出單用及兩藥合用時在各種效應(yīng)時所需藥物質(zhì)量濃度fa/fu=(D/Dm)m，可計算出兩藥合用時在各種效應(yīng)時的合用指數(shù) (Combination index，CI)，CI=D1/DX1+D2/DX2+ αD1D2/DX1DX2，其中 D1、D2為兩藥合用時產(chǎn)生X效應(yīng)時兩藥各自所需質(zhì)量濃度，DX1、DX2為兩藥單獨(dú)使用時產(chǎn)生X效應(yīng)時兩藥各自質(zhì)量濃度。α為常數(shù)，當(dāng)兩種藥物合相互排斥時為0，當(dāng)兩種藥物相互非排斥時為1。靈芝多糖和5-氟尿嘧啶的相互作用為非排斥性，取α=1。CI＜1，協(xié)同;CI=1，相加;CI＞1，拮抗。

2.4 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的檢測 參照文獻(xiàn)［10］，6孔板中接種處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，每孔1×106個細(xì)胞，放置于培養(yǎng)箱過夜。加入不同質(zhì)量濃度的靈芝多糖培養(yǎng)24和48 h，同時設(shè)陰性對照組。胰酶消化細(xì)胞，生理鹽水洗滌3次后，棄上清，－4℃ 70%乙醇固定過夜。PBS洗滌3次，制成單細(xì)胞懸液，加入0.5 mL PI染色液 (50 mg/L PI，1 g/L檸檬酸鈉，10 g/L Triton X-100，1 mg/L RNase A)，4℃避光放置30 min，過400目篩網(wǎng)，流式細(xì)胞儀檢測，Modfit LT軟件分析結(jié)果。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 靈芝多糖和5-氟尿嘧啶對LoVo細(xì)胞的增殖作用

3.1.1 靈芝多糖、5-氟尿嘧啶單獨(dú)用藥抑制LoVo細(xì)胞增殖作用 由圖1可知，與對照組相比，靈芝多糖和5-氟尿嘧啶均對LoVo細(xì)胞顯示出了良好的殺傷效果 (P＜0.01)，并呈劑量和時間依賴性。以靈芝多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL作用72 h抑制率最高，IC50為5.83 mg/mL。5-氟尿嘧啶質(zhì)量濃度為100 μg/mL作用72 h抑制率最高，作用48 h、72 h的 IC50為 36.55 μg/mL、10.73 μg/mL。

3.1.2 靈芝多糖聯(lián)用5-氟尿嘧啶抑制LoVo細(xì)胞增殖作用 結(jié)果見表1。

圖1 靈芝多糖、5-氟尿嘧啶單用對LoVo細(xì)胞增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of Ganoderma lucidum polysaccharide and 5-fluorouracil alone on the proliferation of LoVo cells

表1 靈芝多糖聯(lián)合5-氟尿嘧啶對LoVo的增殖抑制率(n=4)Tab.1 Inhibitory effect of Ganoderma lucidum polysaccharide and 5-fluorouracil on the proliferation of LoVo cells(n=4)

結(jié)果可知，靈芝多糖聯(lián)用5-氟尿嘧啶對腫瘤細(xì)胞LoVo增殖抑制效應(yīng)隨時間的延長而增強(qiáng)，但無劑量上依賴。兩藥聯(lián)用采用聯(lián)合指數(shù)法計算CI值，fa=0.86，即89%的LoVo細(xì)胞生長受抑制時，CI≈1，兩藥聯(lián)合效應(yīng)相加;當(dāng)fa＜0.86，即靈芝多糖質(zhì)量濃度＜14.70 mg/mL，5-氟尿嘧啶質(zhì)量濃度＜0.29 mg/mL時，CI＜1，兩藥聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng);當(dāng)fa＞0.86時，CI＞1，兩藥合用效應(yīng)拮抗。當(dāng)抑制效應(yīng)fa=0.50時，聯(lián)合用藥組 (5-氟尿嘧啶的質(zhì)量濃度為0.86 μg/mL)，相對于5-氟尿嘧啶單獨(dú)應(yīng)用 (5-氟尿嘧啶的質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL)并取得相同效應(yīng)時，5-氟尿嘧啶的劑量減少了10.6倍 (見表2、圖2)。

3.2 靈芝多糖聯(lián)合5-氟尿嘧啶對LoVo凋亡率的影響 流式細(xì)胞儀分析表明，5-氟尿嘧啶單獨(dú)用藥組和聯(lián)合用藥組作用LoVo細(xì)胞24 h后，可見明顯的亞G1峰，即凋亡峰，且隨作用時間延長，凋亡率升高，但無劑量依賴性 (見圖3)。聯(lián)合用藥24 h，1.25 mg/mL 靈芝多糖聯(lián)合 12.5 μg/mL 5-氟尿嘧啶的凋亡率最高 (14.42%)，高于5-氟尿嘧啶組 (11.37%);聯(lián)合用藥48 h，0.625 mg/mL靈芝多糖和6.25 μg/mL 5-氟尿嘧啶聯(lián)合用藥凋亡率最高 (28.92%)，高于5-氟尿嘧啶組(23.29%)。

表2 兩種抗癌藥單用及合用時m、Dm、rTab.2 m、Dm、r of Ganoderma lucidum polysaccharide and 5-fluorouracil alone or combined

圖2 靈芝多糖和5-氟尿嘧啶合用對LoVo細(xì)胞的效應(yīng)與合用指數(shù)曲線Fig.2 Curve of combination index and fraction affected after treatment with Ganoderma lucidum polysaccharide and 5-fluorouracil on LoVo cells

3.3 靈芝多糖聯(lián)合5-氟尿嘧啶對LoVo細(xì)胞周期的影響 與對照組相比，5-氟尿嘧啶干預(yù)LoVo細(xì)胞24、48 h后，G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例下降，S期細(xì)胞比例明顯升高，并呈時間依賴性。兩藥聯(lián)用對LoVo細(xì)胞也具有細(xì)胞周期特異性，但合用濃度的不同對細(xì)胞周期阻滯作用不同。聯(lián)合處理組 (中、低劑量)和5-氟尿嘧啶組較對照組G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例下降，S期細(xì)胞比例明顯升高;聯(lián)合處理組 (高劑量)較對照組G2/M升高。這表明低質(zhì)量濃度聯(lián)合用藥組可使LoVo細(xì)胞阻滯于S期，高質(zhì)量濃度聯(lián)合用藥組使LoVo細(xì)胞阻滯于G2/M期和S期，并呈時間依賴性 (見表3)。

圖3 靈芝多糖聯(lián)合5-氟尿嘧啶對LoVo細(xì)胞48 h后周期和凋亡率的影響Fig.3 Apoptosis rate and cell cycle of LoVo cells after 48 h treatment with 5-fluorouracil and Ganoderma lucidum polysaccharide

表3 靈芝多糖聯(lián)合5-氟尿嘧啶對LoVo細(xì)胞周期和凋亡率的影響Tab.3 Apoptosis and cell cycle of LoVo cells after treatment with 5-fluorouracil and Ganoderma lucidum polysaccharide

4 討論

在腫瘤化療過程中，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也會危害機(jī)體正常的組織和細(xì)胞，損傷人體器官，降低宿主免疫力，并伴隨一系列毒副反應(yīng)，從而影響化療療效。臨床實踐證實，腫瘤患者在接受化療的同時使用適當(dāng)?shù)闹兴?，有助于減輕化療藥物的毒副作用，能增強(qiáng)化療藥物的療效。研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖是一種生物免疫調(diào)節(jié)劑，它通過激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)DNA多聚酶α的活性以及促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)的分泌等途徑來實現(xiàn)其增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能［11］，同時還能增強(qiáng)某些藥物的細(xì)胞毒性［3］。但靈芝多糖聯(lián)合其他化療藥物作用腫瘤細(xì)胞研究甚少，未見靈芝多糖聯(lián)合其他化療藥物作用于結(jié)腸癌細(xì)胞的報道。

本研究通過體外實驗顯示，靈芝多糖和5-氟尿嘧啶單獨(dú)應(yīng)用對LoVo細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并呈時間上和劑量上依賴性。靈芝多糖聯(lián)合5-氟尿嘧啶用藥的凋亡率呈時間依賴性，但無劑量依賴性，且不同時間點兩藥聯(lián)合產(chǎn)生最大的抑制率的靈芝多糖質(zhì)量濃度是不同的。靈芝多糖 (0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)和 5-氟尿嘧啶 (25、50、100 μg/mL)兩藥聯(lián)合應(yīng)用可對LoVo細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同作用。流式細(xì)胞術(shù)顯示靈芝多糖聯(lián)合5-氟尿嘧啶作用LoVo細(xì)胞24 h后，細(xì)胞周期分布發(fā)生了明顯變化。高質(zhì)量濃度兩藥聯(lián)用細(xì)胞周期滯留在S期和G2/M期，低質(zhì)量濃度兩藥聯(lián)用滯留在S期，并呈時間依賴性。5-氟尿嘧啶可使LoVo細(xì)胞周期滯留在S期，與文獻(xiàn)報道一致［12］。

IC50的計算方法主要有 Logic［13］，Bliss［14］及直線回歸等多種計算方法，在數(shù)據(jù)處理過程中發(fā)現(xiàn)，不同的方法算出的IC50也有所不同。Logic等方法計算繁瑣、費(fèi)時，采用直線回歸求IC50常常因為線性關(guān)系不好，結(jié)果偏差較大。且與其他方法相比，以Bliss算法為原理，利用現(xiàn)代高科技計算機(jī)技術(shù)，采用IC50計算軟件計算IC50求IC50較簡便、快捷，而且得到的值較為準(zhǔn)確，故采用IC50計算軟件和聯(lián)合指數(shù)法相結(jié)合，處理靈芝多糖和5-氟尿嘧啶聯(lián)合對LoVo細(xì)胞相互作用的實驗數(shù)據(jù)。

PI(碘化丙啶)能夠與雙鏈DNA/RNA螺旋的大溝部位結(jié)合，它被活細(xì)胞排斥但能穿透正在死亡或已經(jīng)死亡的細(xì)胞的細(xì)胞膜。由于PI不能進(jìn)入完整的活細(xì)胞膜和早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，因此PI標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測是細(xì)胞晚期凋亡率。靈芝多糖和5-氟尿嘧啶聯(lián)用能誘導(dǎo)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡，并有時間依賴性，但無劑量依賴性。用藥24、48 h后，聯(lián)合用藥組的凋亡率 (14.42%、28.92%)高于 5-氟尿嘧啶單獨(dú)用藥組(11.37%、23.29%)。

總之，靈芝多糖聯(lián)合5-氟尿嘧啶對人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖抑制有較好地協(xié)同增效作用，兩藥聯(lián)用對誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞的凋亡也有一定程度的協(xié)同作用，阻滯細(xì)胞周期可能是兩藥聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)理之一。若在臨床上聯(lián)合應(yīng)用靈芝多糖和5-氟尿嘧啶治療結(jié)腸癌，有可能既降低化療藥物的使用劑量減輕化療藥物對患者的毒副作用，同時又能提高療效，具有較好的臨床應(yīng)用前景。由于兩藥互相作用機(jī)制不一樣，用量，給藥的順序還有待進(jìn)一步研究;體內(nèi)實驗結(jié)果與臨床觀察結(jié)果的相關(guān)率較高，還需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實驗探索。

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