王 晶， 偉忠民

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000)

秦皮乙素是從植物秦皮中提取、分離出來的一種內(nèi)酯類化合物［1］，是秦皮的主要有效成分之一，具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用［2］。近年研究顯示，秦皮乙素還具有抗腫瘤作用，有報道顯示秦皮乙素對胸部腫瘤及人類白血病細(xì)胞均具有明顯抑制作用［3-4］。本課題的前期研究表明，秦皮乙素可抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的生長。但有關(guān)秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞作用機(jī)制的研究卻罕見報道。為此本實(shí)驗(yàn)探討了秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞的促凋亡作用及機(jī)制，為臨床更好地開發(fā)利用秦皮乙素提供理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞SMMC-7721購自遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 藥物 秦皮乙素 (購自中國藥品生物制品檢定所，批號:110741-200506);5-氟脲嘧啶 (5-Fu)(天津金耀氨基酸藥業(yè)，10 mL含0.25 g。批號:20101205);兔抗人 Bax抗體 (SANTA CRUZ公司，型號:SC-526);兔抗人Bcl-2抗體 (SANTA CRUZ公司，型號:SC-429);兔抗人Caspase-9抗體 (博奧森公司，型號:BS-0049R);兔抗人Caspase-3抗體 (博奧森公司，型號:BS-0081R)。

1.3 試劑 Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9活性檢測試劑盒 (碧云天生物技術(shù)研究所);線粒體膜電位檢測試劑盒 (JC-1)(碧云天生物技術(shù)研究所);胰蛋白酶 (Hyclone公司);小牛血清 (杭州四季清生物制品公司);DMEM培養(yǎng)基干粉 (GIBCO公司)。其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.4 儀器 熒光顯微鏡 (LEICACTR4000，德國);XD-101型倒置顯微鏡 (OLYMPUS TOKYO JAPAN);流式細(xì)胞儀 (BD FACSCaLibur);凝膠成像儀 (美國BIORAD);超凈工作臺 (江蘇吳縣市凈化技術(shù)研究所);二氧化碳培養(yǎng)箱 (Sheldon Manufacturing IncUSA);酶標(biāo)儀 (9602A北京普朗)，IBO X600活體成像系統(tǒng) (USA)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞SMMC-7721在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2傳代培養(yǎng)，每2～3天換液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［5］。

2.2 JC-1染色檢測SMMC-7721細(xì)胞線粒體膜電位對數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)秦皮乙素低劑量組 (1.12 mmol/L)，中劑量組 (2.24 mmol/L)，高劑量組(4.48mmol/L)培 養(yǎng) 24h，以 5-Fu(0.77 mmol/L)為陽性對照組，以PBS為陰性對照組。

SMMC-7721細(xì)胞密度約為1×106·mL－1，收集細(xì)胞，用PBS洗細(xì)胞1次，加入0.5 mL DMEM培養(yǎng)液和0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。孵育結(jié)束后，600 r/min離心4 min，沉淀細(xì)胞，去上清。用JC-1染色工作液 (1×)洗滌兩次，再用0.5 mL JC-1染色工作液 (1×)重懸后，流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用綠色熒光細(xì)胞百分率表示線粒體膜電位的降低［6］。

2.3 分光光度法檢測SMMC-7721細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性 細(xì)胞分組同2.2項(xiàng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞。PBS洗1次，吸盡上清。加入50 μL裂解液冰浴裂解30 min，12000 r/min，4℃離心10 min，小心吸上清至冰浴預(yù)冷的離心管中。然后在96孔板中每孔加入檢測緩沖液70 μL，待測樣品20 μL，底物Ac-IETD-ρNA 10 μL，混勻，37 ℃ 孵育 120 min。酶標(biāo)儀在405 nm處測定吸光值。通過制作ρNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算Caspase活化程度。每一試驗(yàn)重復(fù)3次以上。

2.4 蛋白印跡法 (Western blot)法檢測SMMC-7721細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-9蛋白的表達(dá)收集5-Fu陽性對照組和PBS陰性對照組及秦皮乙素各濃度組 ［秦皮乙素低劑量組 (1.12 mmol/L)，中劑量組 (2.24 mmol/L)，高劑量組 (4.48 mmol/L和8.96 mmol/L)］，處理24 h的細(xì)胞，用冷PBS洗2次，加入裂解液于4℃裂解30 min，4℃12500 r/min離心5 min，收集上清并測定蛋白濃度。用10%SDS-PAGE分離蛋白，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。加入1∶1000稀釋一抗，4℃過夜，洗膜。再加入1∶1000稀釋的二抗孵育1 h，然后洗膜3次。內(nèi)參照采用β-actin，顯色，照相。

2.5 免疫熒光法檢測 Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá) 蓋玻片使用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)防脫片處理方法處理，六孔板做細(xì)胞爬片。取對數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)秦皮乙素低劑量組 (1.12 mmol/L)，中劑量組 (2.24 mmol/L)，高劑量組 (4.48 mmol/L)培養(yǎng)，以5-Fu(0.77 mmol/L)為陽性對照組，以PBS為陰性對照組。培養(yǎng)24 h后，10%福爾馬林固定30 min，PBS洗3次，30%H2O2和甲醇混合，室溫浸泡15 min，蒸餾水洗3次，滴加3%BSA封閉液25 min，加入1∶500稀釋的一抗，4℃過夜。PBS洗3次，加入1∶200稀釋的二抗，37℃避光孵育20 min，PBS洗3次。封片，熒光顯微鏡下觀察。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 JC-1染色檢測人肝癌細(xì)胞SMMC-7721線粒體膜電位 JC-1是一種熒光探針，當(dāng)線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光;當(dāng)線粒體膜電位較低時，JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。故可通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。結(jié)果見表1，圖1。結(jié)果表明隨著秦皮乙素濃度的增加，細(xì)胞線粒體膜電位下降，且呈劑量依賴性。與對照組比較差異顯著 (P＜0.05)。

表1 秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721線粒體膜電位降低的影響 (n=5，±s)Tab.1 Aesculetin effects on reducing mitochondrial membrane potential of human hepatoma SMMC-7721(n=5，±s)

表1 秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721線粒體膜電位降低的影響 (n=5，±s)Tab.1 Aesculetin effects on reducing mitochondrial membrane potential of human hepatoma SMMC-7721(n=5，±s)

注:與對照組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組 別 線粒體膜電位/%0.07±0.045-Fu 0.77 mmol/L組 25.74±0.16★秦皮乙素1.12 mmol/L組 16.96±0.29★秦皮乙素2.24 mmol/L組 35.81±0.27★★秦皮乙素4.48 mmol/L組 47.15±0.13陰性對照組★★

圖1 秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721線粒體膜電位的影響 (n=5)Fig.1 Effect of aesculetin on mitochondrial membrane potential in human hepatoma SMMC-7721(n=5)

3.2 秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的影響 秦皮乙素(1.12、2.24、4.48 mmol/L)作用人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞24 h后，Caspase-3、Caspase-9活性升高，并呈劑量依賴性。與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。Caspase-8活性基本無變化。結(jié)果見表2。

表2 秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721Caspase活性的影響 (n=5，±s)Tab.2 Effects of aesculetin on Caspase activity in human hepatoma SMMC-7721(n=5，±s)

表2 秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721Caspase活性的影響 (n=5，±s)Tab.2 Effects of aesculetin on Caspase activity in human hepatoma SMMC-7721(n=5，±s)

注:與對照比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

6.86 ±0.15 5.93 ±0.15 22.23 ±0.125-Fu 0.77 mmol/L 組 23.62 ±9.49* 26.63 ±16.11* 29.87 ±6.33*活性陰性對照組組 別 Caspase3活性 Caspase9活性 Caspase8秦皮乙素1.12 mmol/L 組 25.20 ±13.35* 34.59 ±13.54* 50.84 ±7.05*秦皮乙素2.24 mmol/L 組 47.93 ±15.33＊＊ 49.15 ±12.95＊＊ 48.89 ±7.73＊＊秦皮乙素4.48 mmol/L 組 75.73 ±12.87＊＊ 71.45 ±13.29＊＊ 50.65 ±7.65＊＊

3.3 Western blot法檢測SMMC-7721細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase9蛋白的表達(dá) 秦皮乙素 (1.12、2.24、4.48、8.96 mmol/L)作用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞24 h后，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)增加，Caspase-9蛋白表達(dá)也隨著秦皮乙素濃度的增加而增強(qiáng)。見圖2。

圖2 秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞 SMMC-7721 Bax、Bcl-2、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of aesculetin on expressions of protein Bax，Bcl-2 and Caspase-9 in human hepatoma SMMC-7721

3.4 免疫熒光法檢測 Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá) 秦皮乙素 (1.12、2.24、4.48 mmol/L)作用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞24 h后，Bax蛋白的表達(dá)增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)降低，因此Bax/Bcl-2比例顯著升高，進(jìn)而活化Caspase-9、Caspase-3，使 Caspase-9、Caspase-3活性增加。見表3。

表3 秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡調(diào)控蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)的影響 (n=5，±s)Tab.3 Effects of aesculetin on expressions of apoptosis protein Bax，Bcl-2，Caspase-3 and Caspase-9 in human hepatoma SMMC-7721(n=5，±s)

表3 秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡調(diào)控蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)的影響 (n=5，±s)Tab.3 Effects of aesculetin on expressions of apoptosis protein Bax，Bcl-2，Caspase-3 and Caspase-9 in human hepatoma SMMC-7721(n=5，±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

.08 76.01 ±2.675-Fu 0.77 mmol/L組 103.9±2.43* 94.86±2.36 1.095±0.03＊＊ 110.68±7.64 92.04±5.74*秦皮乙素1.12 mmol/L組 126.8±5.67＊＊ 170.25±7.97＊＊ 0.745±0.027＊＊ 131.39±7.61＊＊ 115.36±10.57＊＊秦皮乙素2.24 mmol/L組 144.7±3.11＊＊ 124.77±3.01＊＊ 1.16±0.038＊＊ 179.01±7.92＊＊ 146.45±10.68＊＊秦皮乙素4.48 mmol/L組 172.6±4.99＊＊ 106.51±2.33＊＊ 1.621±0.057＊＊ 200.31±4.94＊＊ 175.13±4.80陰性對照組 92.77±9.86 175.56±0.599 0.529±0.05 91.81±7＊＊Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 Caspase3 Caspase9組 別

4 討論

原發(fā)性肝癌是常見的惡性腫瘤之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，最近10年全球肝癌發(fā)病率及死亡率增長了約22%。細(xì)胞凋亡與腫瘤的關(guān)系備受重視。正常細(xì)胞通過增生和凋亡來維持自身穩(wěn)定，若兩者失衡，則可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

Chu、Wang等［3-4］初步探討了秦皮乙素對人類白血病細(xì)胞和胸部腫瘤的抗腫瘤機(jī)理。主要機(jī)理為促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，活化Caspase-9誘導(dǎo)凋亡，并且具有濃度和時間的依賴性。此外秦皮乙素是 Caspase-3的底物，它可通過激活Caspase-3，促使細(xì)胞凋亡。秦皮乙素作用9 h后，可將Bcl-2蛋白的表達(dá)減少至58%，秦皮乙素作用24 h后可剪切腺苷二磷酸核糖聚合酶 (ADP-ribose)。在前期的研究中，通過MTT法及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，已經(jīng)初步證明秦皮乙素可抑制肝癌細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡［7］。

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程。目前已知兩種信號途徑可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，即由死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑和由線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑。兩種途徑通過分別特異性活化Caspase-8和Caspase-9，最后都作用于Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在內(nèi)源性途徑中，線粒體膜電位降低是細(xì)胞凋亡過程中的首要事件。在線粒體內(nèi)、外膜交界處存在膜滲透性轉(zhuǎn)換通道，該通道的開放會引起線粒體膜電位的下降，呼吸鏈斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。本試驗(yàn)采用熒光探針JC-1檢測線粒體膜電位的變化，結(jié)果顯示，秦皮乙素作用24 h后，呈濃度依賴性地使人肝癌細(xì)胞SMMC-7721線粒體膜電位下降。表明線粒體參與了秦皮乙素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡發(fā)生。

Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞通過內(nèi)源性途徑促進(jìn)凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，決定細(xì)胞能否通過改變線粒體膜電位激活Caspase家族，最終發(fā)生凋亡。為此本試驗(yàn)通過蛋白印跡法和免疫熒光法研究秦皮乙素對Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，秦皮乙素在抑制Bcl-2蛋白表達(dá)的同時使Bax蛋白的表達(dá)增加。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，秦皮乙素可通過活化Caspase-3，Caspase-9而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)。

可見，秦皮乙素能夠降低人肝癌細(xì)胞SMMC-7721線粒體膜電位，同時抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，升高Bax/Bcl-2比例?；罨疌aspase-3，Caspase-9。通過內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡。

本實(shí)驗(yàn)對于秦皮乙素抗腫瘤機(jī)制的研究還不夠深入，只是探討了其對腫瘤細(xì)胞凋亡方面的影響，秦皮乙素能否增強(qiáng)機(jī)體免疫;對腫瘤相關(guān)的癌基因與抑癌基因的表達(dá)是否有影響;對腫瘤細(xì)胞的黏附、生長、轉(zhuǎn)移是否有抑制作用等，都需要更深入的探討。

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