王 寧

(湖南省懷化市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南懷化418000)

解風(fēng)酒是由當(dāng)歸、狗脊、桂枝、獨(dú)活等多味中藥制成的復(fù)方制劑。處方源于經(jīng)驗(yàn)方，具有祛風(fēng)除濕，舒經(jīng)通絡(luò)止痛的作用。用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)制劑中活性成分當(dāng)歸、狗脊、桂枝進(jìn)行薄層色譜鑒別，無(wú)相關(guān)的定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，為了更有效控制本品內(nèi)在質(zhì)量，采用高效液相色譜法對(duì)方中的阿魏酸、原兒茶酸及桂皮醛進(jìn)行定量測(cè)定。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀，包括LC-20AT輸液泵，SPD-M20Avp二極管陣列檢測(cè)器，LCsolution工作站;AUW220D十萬(wàn)分之一電子天平(日本島津公司)，CBL9960A超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀有限公司)。

阿魏酸(批號(hào):110773-200612)、原兒茶酸(批號(hào):110810-200506)、桂 皮 醛 (批 號(hào):110710-200513)對(duì)照品(均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供);解風(fēng)酒(湖南懷化市中醫(yī)院制劑，批號(hào)為100322、100902、101003);甲醇、乙腈、冰醋酸均為色譜純;水為超純水;其它試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相 A乙腈-B 0.1%冰醋酸溶液，梯度洗脫(0～35 min，75%B ～55%B);體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm;進(jìn)樣量10 μL。按阿魏酸峰計(jì)算，理論板數(shù)不低于4000;按原兒茶酸、桂皮醛計(jì)算，理論板數(shù)不低于5000。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱定經(jīng)減壓干燥18 h的阿魏酸 12.13 mg，原兒茶酸 12.51 mg，桂皮酸對(duì)照品5.24 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，作為混合對(duì)照品溶液，避光備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密量取解風(fēng)酒20 mL，置50 mL量瓶中加70%甲醇適量溶解，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)25 min，再加70%甲醇至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備 按處方比例稱取缺當(dāng)歸、狗脊及桂枝以外的其余藥材，按制備工藝制成陰性制劑，再按2.3項(xiàng)下的方法制備陰性供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取陰性供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，依法測(cè)定。阿魏酸、原兒茶酸及桂皮醛的保留時(shí)間分別約為 12.8，21.2，27.6 min，與混合對(duì)照品溶液的色譜保留時(shí)間一致;陰性供試品溶液在該色譜條件下對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液 2、4、6、8、10、20 μL 分別注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得阿魏酸、原兒茶酸、桂皮醛的回歸方程分別為 A=2.33×106C－3.21×104(r=0.9999)，A=2.42 × 106C － 1.39 × 104(r=0.9999)，A=1.47 × 106C － 2.67 × 103(r=0.9999)。結(jié)果表明阿魏酸、原兒茶酸、桂皮醛分別在 0.02426 ～ 0.2426 μg、0.02502 ～ 0.2502 μg、0.01048 ～0.1048 μg 范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下的方法連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定阿魏酸、原兒茶酸、桂皮醛的峰面積，峰面積RSD分別為 0.48%、0.99% 、0.93%。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)解風(fēng)酒(批號(hào):100322)6份 ，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果阿魏酸、原兒茶酸、桂皮醛的RSD 分別為 1.01%、0.69%、0.98%。

圖1 解風(fēng)酒HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Jiefeng Wine

2.5.5 穩(wěn)定性考察 吸取供試品 (批號(hào):100322)，按2.3項(xiàng)下的制備條件，于室溫放置0、4、8、12、24 h后按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行，分別測(cè)定阿魏酸、原兒茶酸、桂皮醛的峰面積，RSD分別為0.74%、0.80%、0.65%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取同一批號(hào)樣品(批號(hào) 100322，含阿魏酸 2.55 mg/瓶;原兒茶酸4.12 mg/瓶;桂皮醛 1.27 mg/瓶;每瓶 500 mL)10 mL，共9份，分別置50 mL量瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(阿魏酸0.01213 mg/mL、原兒茶酸0.01251 mg/mL 和桂皮醛 0.00524 mg/mL)5.0，6.0和7.0 mL，按2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下的色譜條件，依法測(cè)定，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5.7 樣品測(cè)定 取3批樣品，按2.2和2.3項(xiàng)下的方法分別制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，依次對(duì)3批次樣品(批號(hào):100322，100902，101003)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 對(duì)阿魏酸、原兒茶酸及桂皮醛進(jìn)行紫外全波段掃描，三者均在260 nm波長(zhǎng)處有較大的紫外吸收，故采取260 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表1 加樣回收率結(jié)果Tab.1 The results of Recovery test

表2 解風(fēng)酒中阿魏酸、原兒茶酸、桂皮醛測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Test results of samples(n=3)

3.2 提取溶劑與提取時(shí)間的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別采用50%甲醇、70%甲醇、甲醇作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取的樣品含有量較其他溶劑高，且雜質(zhì)影響較小;同時(shí)還考察了 15、25、35、45 min不同提取時(shí)間對(duì)樣品的影響，結(jié)果25 min時(shí)提取最完全，且所測(cè)成分穩(wěn)定。

3.3 柱溫的設(shè)定 本方法采用的是梯度洗脫，在測(cè)定中不設(shè)柱溫，色譜峰基線漂移較嚴(yán)重，樣品峰拖尾明顯，設(shè)定柱溫后，可減少拖尾，基線漂移得到改善，峰形對(duì)稱，但柱溫設(shè)定不易過(guò)高，過(guò)高峰形變差，故柱溫設(shè)定為30℃為佳。

3.4 流動(dòng)相及洗脫方式的選擇 參閱相關(guān)文獻(xiàn)［1-11］，分別使用了甲醇-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等不同類型、比例的流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選用乙腈-0.1%冰醋酸溶液且進(jìn)行二元梯度洗脫，結(jié)果表明，此洗脫相能更好地分離阿魏酸、原兒茶酸與桂皮醛峰，各主峰之間的分離度均大于1.5，且陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

3.5 該品種為臨床常用制劑，為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用本法同時(shí)測(cè)定解風(fēng)酒中阿魏酸、原兒茶酸和桂皮醛，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，能夠有效控制解風(fēng)酒的內(nèi)在質(zhì)量，為臨床用藥提供安全保障。

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