徐丁潔， 成秀梅， 杜惠蘭*， 徐 洪

(1.河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合婦科教研室，河北石家莊050091;2.河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合外科教研室，河北石家莊050091;3.河北醫(yī)科大學(xué)病理科，河北唐山063000)

寒證為八綱之一，婦科寒證是臨床較為多見(jiàn)的病證之一。我們?cè)鴮?duì)1122名婦女進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，屬月經(jīng)病寒證者411人，占36.63%［1］。寒客沖任、胞宮，影響女性正常經(jīng)孕。正常月經(jīng)一方面依賴于下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)功能正常，促使卵泡發(fā)育成熟，分泌雌、孕激素。另一方面，雌、孕激素須與子宮內(nèi)膜組織中的相應(yīng)受體結(jié)合，才能發(fā)揮其生理作用［2］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究加減溫經(jīng)湯對(duì)寒凝血瘀模型大鼠卵巢激素雌二醇(Estradiol，E2)和孕酮(Progesterone，P)水平及子宮內(nèi)膜雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)、孕激素受體(Progesterone Receptor，PR)表達(dá)的影響，探討其治療寒凝血瘀型婦科疾病的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雌性，鼠齡3個(gè)月，體質(zhì)量(190±10)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(冀)2008-1-003，合格證號(hào)1006025。

1.2 試劑 加減溫經(jīng)湯:當(dāng)歸10 g、川芎10 g、白芍10 g、肉桂10 g、莪術(shù) 10 g、丹皮 10 g、吳茱萸 10 g、懷牛膝 12 g、甘草6 g，一次性購(gòu)于石家莊樂(lè)仁堂藥業(yè)。首先將當(dāng)歸、川芎、莪術(shù)、肉桂、吳茱萸5種藥物浸泡，然后加入8倍量的水，用蒸餾法提取揮發(fā)油，密閉保存。取藥渣與浸泡的其他藥物一起水煎3次，30 min/次，過(guò)濾，共得藥液 1200 mL，離心、濃縮至含生藥3.52 g/mL。將藥液置4℃冰箱備用，用時(shí)取出，與揮發(fā)油混合，用蒸餾水稀釋至所用濃度。

E2(批號(hào)RG60905)、P(批號(hào)RG50905)放免試劑盒購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。

一抗:ERα(SC-542)、PR(SC-538)(兔抗大鼠)工作液購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology。二抗:SP－9001兔 SP kit，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。濃縮型DAB試劑盒，ZLI-9032，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 造模方法及分組 大鼠30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、治療組，每組10只。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，另兩組大鼠置于0～1℃冰水中20 min，1次/d，連續(xù)2周［3］。治療組于造模的第1天開(kāi)始，每日分別按29.32 g/kg(相當(dāng)于臨床成人劑量的20倍)給予加減溫經(jīng)湯灌胃，連續(xù)2周。

1.4 陰道上皮細(xì)胞檢查 每日上午、下午各做陰道涂片一次，處死前2 d，每隔2 h涂片一次以確定動(dòng)情周期，以0.5%的堿性美藍(lán)溶液染色10 min，自來(lái)水輕輕洗去多余的染色液，待干，用普通光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5 取材方法 擇動(dòng)情期間斷頭取血，制備血清，放射免疫分析法檢測(cè)E2、P。取子宮，吸去血跡，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察子宮內(nèi)膜ER、PR的表達(dá)。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟到水。滴加0.1%的胰酶，37℃烤箱中孵育10 min。PBS沖洗，3 min×3次。3%H202去離子水室溫孵育10 min。PBS沖洗，3 min×3次。10%正常山羊血清封閉非特異性抗原，37℃烤箱中孵育10 min，傾去，勿洗。滴加1∶200稀釋的一抗，4℃過(guò)夜。PBS沖洗，3 min×3次。滴加生物素標(biāo)記的二抗IgG，37℃烤箱中孵育10 min。PBS沖洗，3 min×3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃烤箱中孵育10 min。PBS沖洗，3 min×3次。室溫下DAB顯色2～5 min。自來(lái)水終止顯色，蘇木復(fù)染，返藍(lán)，脫水，透明，封片。

切片均在同一條件下按SP法進(jìn)行免疫組化染色。用已知的陽(yáng)性切片同時(shí)在同一條件下染色作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.7 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每個(gè)組織隨機(jī)選取1張切片進(jìn)行分析，應(yīng)用Image pro plus 6.0專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像采集和分析。于每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野，各采集1張200倍的圖像，計(jì)算積分光密度(integral optical density，IOD)值，6張圖像的IOD平均值作為該片指標(biāo)的代表值。平均光度值越高，表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般狀況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，正常組和治療組大鼠外觀無(wú)明顯差異，毛色白而光澤，精神狀況佳，活潑，反應(yīng)靈敏;模型組大鼠精神不振，毛色不榮，尾涼，少動(dòng)、大部分出現(xiàn)腹瀉。

2.2 動(dòng)情周期的變化 根據(jù)陰道上皮脫落細(xì)胞［4］判斷大鼠動(dòng)情周期，分為動(dòng)情前期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期。比較各組大鼠處死前最后一個(gè)動(dòng)情周期各階段時(shí)間的變化。

與正常組比較，模型組大鼠動(dòng)情周期及動(dòng)情間期延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，與模型組比較，治療組大鼠動(dòng)情周期及動(dòng)情間期縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，并且恢復(fù)至正常水平(均P＞0.05)。動(dòng)情前期及動(dòng)情后期各組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組之間動(dòng)情周期比較(±s)

表1 各組之間動(dòng)情周期比較(±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05。

/d正常組組別 動(dòng)物數(shù)/只動(dòng)情周期/d動(dòng)情間期/d動(dòng)情前期/d動(dòng)情后期10 4.1 ±0.4 1.4 ±0.3 1.5 ±0.4 1.7 ±0.5模型組 10 5.0 ±0.9* 2.1 ±0.5* 1.8 ±0.7 1.9 ±0.7治療后 10 4.3 ±0.7# 1.7 ±0.4#1.7 ±0.5 1.9 ±0.6

2.3 血清E2、P值變化 與正常組比較，模型組血清 E2、P值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，治療組血清E2、P值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，并且均恢復(fù)至正常水平(均P＞0.05)。(見(jiàn)表2)

表2 各組之間血清E2、P值比較(±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 E2/(pg·mL－1) P/(ng·mL－1)正常組10 41.32 ±15.02 4.87 ±0.79模型組 10 26.03 ±10.90* 3.62 ±0.61＊＊治療組 10 38.64 ±13.73# 4.51 ±0.71#

2.4 子宮內(nèi)膜ER、PR平均光密度值變化 與正常組比較，模型組子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01);與模型組比較，治療組子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，ER表達(dá)恢復(fù)至正常水平(P ＞0.05)。(見(jiàn)表3)

表3 各組之間子宮內(nèi)膜ER、PR平均光密度值比較(±s)

表3 各組之間子宮內(nèi)膜ER、PR平均光密度值比較(±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05。

ER PR正常組組別 動(dòng)物數(shù)/只10 253.86 ±26.72 207.84 ±23.66模型組 10 211.03 ±23.11＊＊ 163.22 ±18.78＊＊治療組 10 236.81 ±24.43# 185.91 ±20.01*#

3 討論

“婦人以血為本”，寒為陰邪，性主收引、凝滯，極易與血搏結(jié)。寒客沖任、胞宮，可使經(jīng)脈拘攣，血行瘀滯，“不通則痛”，發(fā)為痛經(jīng);或沖任、胞脈被阻，胞宮不能按時(shí)滿盈，而導(dǎo)致月經(jīng)后期月經(jīng)過(guò)少、閉經(jīng)、不孕癥等。根據(jù)“寒者熱之”、“結(jié)者散之”的治則，我們擬定溫經(jīng)散寒、活血化瘀調(diào)經(jīng)之加減溫經(jīng)湯。前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)本方可通過(guò)改善生殖內(nèi)分泌激素、調(diào)節(jié)致痛及鎮(zhèn)痛物質(zhì)，改善卵巢功能，治療寒凝血瘀型婦科疾?。?-8］。本實(shí)驗(yàn)從子宮內(nèi)膜受體方面進(jìn)一步完善其作用機(jī)制。

正常婦女的月經(jīng)周期中，子宮內(nèi)膜ER、PR呈周期性變化，在增殖期雌激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜 ER、PR的合成，ER、PR含量逐漸增加，于增殖末期達(dá)高峰。在分泌期，由于孕激素抑制子宮內(nèi)膜ER、PR的合成，子宮內(nèi)膜ER、PR含量均下降［2］。子宮內(nèi)膜ER、PR的異常表達(dá)將影響E2和P值對(duì)內(nèi)膜的發(fā)育、合成和分泌功能，影響子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)［9-10］。女性激素水平及子宮內(nèi)膜組織中相應(yīng)受體含量任一方面減低或功能異常，都可使子宮內(nèi)膜發(fā)生形態(tài)或功能的改變，繼而影響婦女正常的經(jīng)孕過(guò)程［11-13］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，寒凝血瘀模型組大鼠外觀及精神均欠佳。陰道細(xì)胞雖呈周期性變化，但表現(xiàn)為動(dòng)情周期延長(zhǎng)，主要是動(dòng)情間期延長(zhǎng)。模型組大鼠血清E2、P值較正常組明顯下降，子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)亦降低;經(jīng)加減溫經(jīng)湯治療后，血清E2、P值水平升高，子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)增強(qiáng)，且血清E2、P值及子宮內(nèi)膜ER表達(dá)恢復(fù)至正常水平。表明加減溫經(jīng)湯可調(diào)節(jié)卵巢激素水平，增強(qiáng)子宮內(nèi)膜ER、PR的表達(dá)，修復(fù)寒邪對(duì)子宮內(nèi)膜的損傷，調(diào)節(jié)HPOA，使其達(dá)到一種平衡狀態(tài)，綜合作用下達(dá)到治療寒凝血瘀型婦科疾病的目的。本實(shí)驗(yàn)卵巢激素水平、子宮內(nèi)膜受體表達(dá)從兩方面，揭示了寒凝血瘀型婦科疾病發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制，完善了加減溫經(jīng)湯治療寒凝血瘀型婦科疾病的機(jī)理。

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