宋 瑱， 李慶勇， 王春成， 高文輕， 姜春菲， 桑 梅

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040)

獨角蓮Typhonium giganteum Engl.是天南星科Araceae犁頭尖屬Typhonium植物，中醫(yī)用其塊莖入藥用于治療中風(fēng)痰壅、口眼歪斜、跌打損傷、毒蛇叮咬等癥［1-2］。孫淑芬等報道其具有抗腫瘤活性［3］。近年來的研究顯示癌癥與體內(nèi)過氧化反應(yīng)有著密切關(guān)系，而至今都沒有關(guān)于獨角蓮的抗氧化活性方面的報道。本實驗通過兩種抗氧化能力分析(DPPH和ABTS)來評價熱回流提取、超聲提取、負(fù)壓空化提取3種不同工藝獲得的獨角蓮塊莖提取物的活性。有文獻(xiàn)報道［4］黃酮和酚類都是具有酚羥基的還原性化合物，在復(fù)雜的反應(yīng)體系中由于自身被氧化而具有清除自由基和抗氧化作用，為了確定獨角蓮醇提物中有效的抗氧化活性成分，本實驗分別用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法和福林法對獨角蓮醇提物的總黃酮和總多酚進(jìn)行測定，希望為進(jìn)一步更深入和更充分的開發(fā)利用獨角蓮提供一定的依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料 Unico2100紫外-可見分光光度計，KQ-250DB數(shù)控超聲儀，DGX-9073 B-2鼓風(fēng)干燥箱(上海福瑪實驗設(shè)備有限公司)，AB104電子天平，帕恩特超純水機(jī)，ZLS系列真空離心濃縮儀(湖南赫西儀器裝備有限公司)，RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，Stat Fax-3200酶標(biāo)儀(美國AWARENESS公司)。

獨角蓮于2010年10月購于吉林省獨角蓮種植開發(fā)基地，為四年生根莖，打成粉過20目篩。DPPH(1，1-diphenyl-2-pierylhydrazyl)試劑購自美國 Sigma公司;ABTS［2，2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)］抗氧化試劑盒內(nèi)含 trolox(6-Hydroxy-2，5，7，8-tetram ethylchroman-2-carboxylic acid)購自碧云天生物技術(shù)研究所;蘆丁(Rutin)標(biāo)準(zhǔn)品(98%);沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(98%，浙江省溫州市甌?；ぴ噭S);水為超純水;乙醇為分析純。

1.2 獨角蓮塊莖活性成分的提取 稱取獨角蓮塊莖粉末10 g共3份，分別采用熱回流提取法、超聲提取法、負(fù)壓空化提取法提取活性成分。熱回流提取法工藝參數(shù):80%乙醇溶液，提取溫度80℃，提取時間1 h，料液比1(g)∶10(mL)，共提取2次。超聲提取法工藝參數(shù):80%乙醇溶液，提取溫度50℃，提取時間1 h，料液比1(g)∶10(mL)，共提取2次。負(fù)壓空化提取法工藝參數(shù):80%乙醇溶液，提取時間1 h，料液比1(g):10(mL)，共提取2次。上述提取液過濾后于60℃減壓濃縮，所得浸膏真空干燥后放于－4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

提取率(%)=提取所得浸膏的質(zhì)量/提取所用原料的質(zhì)量×100

1.3 抗氧化能力的測定

1.3.1 DPPH法測定抗氧化能力 將浸膏用80%乙醇溶解，分別配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL 的不同質(zhì)量濃度樣品，每2 mL樣品溶液分別加入DPPH試劑2 mL(0.04 mg/mL)，避光放置反應(yīng)30 min，以未加DPPH的80%乙醇為空白校正，以未加樣品的DPPH溶液為空白對照，分別測517 nm處吸光度。吸光度的減少反映了抗DPPH自由基的活性。每組實驗平行進(jìn)行3次。

自由基清除率用以下公式計算得出:

DPPH 清除率(%)=(A對照－A樣品)÷A對照×100%

A樣品=不同濃度樣品與DPPH反應(yīng)后的吸光值

A對照=同體積的溶劑和DPPH試劑的吸光值

1.3.2 ABTS法測定抗氧化能力 獨角蓮80%乙醇提取物的總抗氧化能力采用碧云天ABTS總抗氧化能力測試試劑盒對其進(jìn)行抗氧活性評價，實驗方法按照試劑盒說明將ABTS溶液與氧化劑溶液等體積混勻后作為工作母液于室溫避光保存12～16 h，使用前用80%乙醇稀釋100倍，使吸光度在405 nm 波長處為0.7±0.02，得到ABTS+工作液。取稀釋的ABTS+工作液0.2 mL置于96孔板中，分別加入不同濃度的 Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.15 ～1.5 mmol/L)和 0.01 mL 各樣品溶液(1.5 mg/mL)，混勻后室溫下反應(yīng)5 min，用酶標(biāo)儀以405 nm為檢測波長，450 nm為參比波長檢測樣品吸光度。以未加ABTS+工作液的80%乙醇為空白校正，以未加樣品的ABTS+工作液為空白對照，每份樣品平行操作3次。將Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液制成標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y=0.1202X+0.1178，R2=0.9932，式中:X 為 Trolox濃度(mmol/L)，Y為吸光度。樣品總抗氧化能力與Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液比較，確定其相對抗氧化能力(TEAC)。

1.4 抗氧化物質(zhì)的測定

1.4.1 總黃酮的測定 精密稱取蘆丁10.0 mg，60%乙醇完全溶解后定容至100 mL作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于 10 mL具塞試管中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，6 min后再分別加入10%硝酸鋁水溶液0.30 mL，搖勻放置6 min;然后分別加入4%氫氧化鈉水溶液4.00 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min后，以試劑為空白，在510 nm處測吸光度，由吸光度對質(zhì)量濃度建立回歸方程:Y=13.18X －0.0398，相關(guān)系數(shù):R2=0.9983，式中:X 為黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，Y為吸光度。用60%乙醇將獨角蓮塊莖提取物配制成5 mg/mL溶液，依照上述方法顯色后在510 nm處測吸光值，依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃酮的質(zhì)量濃度，并計算出各工藝提取物中黃酮成分的含有量。

1.4.2 總多酚的測定 精密稱取沒食子酸0.10 g用60%乙醇完全溶解后定容至100 mL，用移液槍分別移取0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL 定容至 10 mL，分別取出 1 mL溶液置于10 mL具塞試管中，再分別加入5 mL超純水，1 mL福林試劑和7.5%Na2CO3溶液3 mL。充分混勻后在45℃下水浴1.5 h在765 nm處測吸光值。其線性方程為:Y=17.567X －0.0523;R2=0.9994，式中:X 為多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)，Y為吸光度。用60%乙醇將獨角蓮塊莖提取物配制成1 mg/mL溶液依照上述方法顯色后在765 nm處測吸光值，依據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多酚的質(zhì)量濃度，并計算出各工藝提取物中多酚成分的量。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化能力分析

2.1.1 DPPH自由基清除能力 試驗中不同工藝獨角蓮塊莖提取物的自由基清除活性見圖1。圖1顯示:獨角蓮塊莖提取物對DPPH自由基有清除能力，并且在一定范圍內(nèi)呈質(zhì)量濃度依賴關(guān)系，清除率隨質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，熱回流和超聲兩種提取物對DPPH自由基的清除率均達(dá)到最大值，分別為90.34%和87.12%，而負(fù)壓空化提取物的清除率為80.07%。熱回流提取物、超聲提取物、負(fù)壓空化提取物對DPPH自由基的半清除率EC50見表1。

表1 獨角蓮塊莖提取物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力(n=3)

2.1.2 清除ABTS自由基的能力 熱回流提取物、超聲提取物、負(fù)壓空化提取物對ABTS自由基的總抗氧化能力與Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液比較所得的相對抗氧化能力見表1。

圖1、表1顯示，提取物的抗氧化能力強(qiáng)弱順序為熱回流提取物＞超聲提取物＞負(fù)壓空化提取物。

2.2 獨角蓮塊莖提取物總黃酮和總多酚的測定 從表2中可以看出獨角蓮塊莖成分的提取效率為熱回流提?。境曁崛。矩?fù)壓空化提取;總黃酮量由高到低為熱回流提取物＞超聲提取物＞負(fù)壓空化提取物;總酚量由高到低為熱回流提取物＞負(fù)壓空化提取物＞超聲提取物。熱回流、超聲和負(fù)壓空化這3種提取物中，總黃酮和總多酚的總量分別約為34.82%、29.73%和31.14%。其中負(fù)壓空化提取對獨角蓮塊莖成分的提取率(6.46%)雖然很低，但是提取物中總黃酮和總酚的量還是很高的，約占總提取物的31.14%。

表2 不同工藝下獨角蓮塊莖提取物中總黃酮和總多酚的量

3 結(jié)論

醫(yī)學(xué)研究表明自由基及其代謝產(chǎn)物能夠誘發(fā)多種疾病，例如糖尿病、白內(nèi)障、炎癥、動脈粥樣硬化、心血管疾病、癌癥等。已有研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的化學(xué)合成抗氧化劑具有一定的副作用和致癌性等缺點，不宜長期使用［7］。而許多天然抗氧化劑能夠促進(jìn)體內(nèi)抗氧化酶與內(nèi)源性抗氧化劑的合成，有效清除體內(nèi)過多自由基，因此越來越多的學(xué)者關(guān)注天然抗氧化劑的研究［5-8］。獨角蓮作為一種傳統(tǒng)的中藥在免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等方面有廣泛的藥理作用［9］，但迄今為止，有關(guān)其抗氧化活性方面的研究還未見報道。

本實驗通過使用DPPH試劑和ABTS總抗氧化能力試劑盒分別對3種不同工藝的獨角蓮塊莖提取物進(jìn)行了抗氧化能力的測試，圖1和表1都可以看出3種獨角蓮塊莖提取物對DPPH自由基和ABTS自由基均具有清除活性，清除能力強(qiáng)弱順序均為熱回流提取物＞超聲提取物＞負(fù)壓空化提取物。

表2顯示:3種不同工藝的獨角蓮塊莖提取物的總黃酮和總多酚測定中，熱回流提取物的總黃酮和總酚量明顯高于超聲提取物和負(fù)壓空化提取物，這也印證了3種提取物中熱回流提取物的抗氧化活性最好的結(jié)論。超聲提取物的總黃酮量略高于負(fù)壓空化提取物的總黃酮量，而負(fù)壓空化提取物的總酚量微高于超聲提取物，結(jié)果與兩種提取方法的提取物的抗氧化能力相似。

3種不同提取方法中熱回流提取效率最高，并且熱回流提取物的抗氧化活性最好，提取物中總黃酮和總多酚的含有量也是最高的，這一系列的實驗結(jié)果可為今后獨角蓮抗氧化活性成分總黃酮及總酚的高效提取提供依據(jù)。

3種不同工藝的提取物的抗氧化能力不同，其原因可能是由于不同提取物中抗氧化成分組成和含有量不同，而且其中各物質(zhì)的協(xié)同作用可能不一致，導(dǎo)致了不同方法提取的獨角蓮塊莖提取物的抗氧化能力不同。其機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究，這也是今后研究的目標(biāo)。

本研究為利用獨角蓮塊莖開發(fā)天然抗氧化功效因子提供了依據(jù)，但由于是在體外進(jìn)行研究，而生物體內(nèi)的氧化代謝是很復(fù)雜的，因此，還有待于從生物體內(nèi)源抗氧化酶系活性和生物大分子氧化代謝產(chǎn)物水平的角度來進(jìn)一步研究獨角蓮塊莖的抗氧化作用機(jī)制。

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［4］趙繼紅，梁 宇，顏達(dá)予.黃酮類化合物抗氧化活性的結(jié)構(gòu)因素［J］.北方工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，13(1):36-43.

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