宋 瑱， 李慶勇， 王春成， 高文輕， 姜春菲， 桑 梅

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040)

獨(dú)角蓮Typhonium giganteum Engl.是天南星科Araceae犁頭尖屬Typhonium植物，中醫(yī)用其塊莖入藥用于治療中風(fēng)痰壅、口眼歪斜、跌打損傷、毒蛇叮咬等癥［1-2］。孫淑芬等報(bào)道其具有抗腫瘤活性［3］。近年來的研究顯示癌癥與體內(nèi)過氧化反應(yīng)有著密切關(guān)系，而至今都沒有關(guān)于獨(dú)角蓮的抗氧化活性方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過兩種抗氧化能力分析(DPPH和ABTS)來評(píng)價(jià)熱回流提取、超聲提取、負(fù)壓空化提取3種不同工藝獲得的獨(dú)角蓮塊莖提取物的活性。有文獻(xiàn)報(bào)道［4］黃酮和酚類都是具有酚羥基的還原性化合物，在復(fù)雜的反應(yīng)體系中由于自身被氧化而具有清除自由基和抗氧化作用，為了確定獨(dú)角蓮醇提物中有效的抗氧化活性成分，本實(shí)驗(yàn)分別用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法和福林法對(duì)獨(dú)角蓮醇提物的總黃酮和總多酚進(jìn)行測(cè)定，希望為進(jìn)一步更深入和更充分的開發(fā)利用獨(dú)角蓮提供一定的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料 Unico2100紫外-可見分光光度計(jì)，KQ-250DB數(shù)控超聲儀，DGX-9073 B-2鼓風(fēng)干燥箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，AB104電子天平，帕恩特超純水機(jī)，ZLS系列真空離心濃縮儀(湖南赫西儀器裝備有限公司)，RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，Stat Fax-3200酶標(biāo)儀(美國(guó)AWARENESS公司)。

獨(dú)角蓮于2010年10月購(gòu)于吉林省獨(dú)角蓮種植開發(fā)基地，為四年生根莖，打成粉過20目篩。DPPH(1，1-diphenyl-2-pierylhydrazyl)試劑購(gòu)自美國(guó) Sigma公司;ABTS［2，2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)］抗氧化試劑盒內(nèi)含 trolox(6-Hydroxy-2，5，7，8-tetram ethylchroman-2-carboxylic acid)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;蘆丁(Rutin)標(biāo)準(zhǔn)品(98%);沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(98%，浙江省溫州市甌?；ぴ噭S);水為超純水;乙醇為分析純。

1.2 獨(dú)角蓮塊莖活性成分的提取 稱取獨(dú)角蓮塊莖粉末10 g共3份，分別采用熱回流提取法、超聲提取法、負(fù)壓空化提取法提取活性成分。熱回流提取法工藝參數(shù):80%乙醇溶液，提取溫度80℃，提取時(shí)間1 h，料液比1(g)∶10(mL)，共提取2次。超聲提取法工藝參數(shù):80%乙醇溶液，提取溫度50℃，提取時(shí)間1 h，料液比1(g)∶10(mL)，共提取2次。負(fù)壓空化提取法工藝參數(shù):80%乙醇溶液，提取時(shí)間1 h，料液比1(g):10(mL)，共提取2次。上述提取液過濾后于60℃減壓濃縮，所得浸膏真空干燥后放于－4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

提取率(%)=提取所得浸膏的質(zhì)量/提取所用原料的質(zhì)量×100

1.3 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.1 DPPH法測(cè)定抗氧化能力 將浸膏用80%乙醇溶解，分別配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL 的不同質(zhì)量濃度樣品，每2 mL樣品溶液分別加入DPPH試劑2 mL(0.04 mg/mL)，避光放置反應(yīng)30 min，以未加DPPH的80%乙醇為空白校正，以未加樣品的DPPH溶液為空白對(duì)照，分別測(cè)517 nm處吸光度。吸光度的減少反映了抗DPPH自由基的活性。每組實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次。

自由基清除率用以下公式計(jì)算得出:

DPPH 清除率(%)=(A對(duì)照－A樣品)÷A對(duì)照×100%

A樣品=不同濃度樣品與DPPH反應(yīng)后的吸光值

A對(duì)照=同體積的溶劑和DPPH試劑的吸光值

1.3.2 ABTS法測(cè)定抗氧化能力 獨(dú)角蓮80%乙醇提取物的總抗氧化能力采用碧云天ABTS總抗氧化能力測(cè)試試劑盒對(duì)其進(jìn)行抗氧活性評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)方法按照試劑盒說明將ABTS溶液與氧化劑溶液等體積混勻后作為工作母液于室溫避光保存12～16 h，使用前用80%乙醇稀釋100倍，使吸光度在405 nm 波長(zhǎng)處為0.7±0.02，得到ABTS+工作液。取稀釋的ABTS+工作液0.2 mL置于96孔板中，分別加入不同濃度的 Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.15 ～1.5 mmol/L)和 0.01 mL 各樣品溶液(1.5 mg/mL)，混勻后室溫下反應(yīng)5 min，用酶標(biāo)儀以405 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，450 nm為參比波長(zhǎng)檢測(cè)樣品吸光度。以未加ABTS+工作液的80%乙醇為空白校正，以未加樣品的ABTS+工作液為空白對(duì)照，每份樣品平行操作3次。將Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液制成標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y=0.1202X+0.1178，R2=0.9932，式中:X 為 Trolox濃度(mmol/L)，Y為吸光度。樣品總抗氧化能力與Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液比較，確定其相對(duì)抗氧化能力(TEAC)。

1.4 抗氧化物質(zhì)的測(cè)定

1.4.1 總黃酮的測(cè)定 精密稱取蘆丁10.0 mg，60%乙醇完全溶解后定容至100 mL作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于 10 mL具塞試管中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，6 min后再分別加入10%硝酸鋁水溶液0.30 mL，搖勻放置6 min;然后分別加入4%氫氧化鈉水溶液4.00 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min后，以試劑為空白，在510 nm處測(cè)吸光度，由吸光度對(duì)質(zhì)量濃度建立回歸方程:Y=13.18X －0.0398，相關(guān)系數(shù):R2=0.9983，式中:X 為黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，Y為吸光度。用60%乙醇將獨(dú)角蓮塊莖提取物配制成5 mg/mL溶液，依照上述方法顯色后在510 nm處測(cè)吸光值，依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮的質(zhì)量濃度，并計(jì)算出各工藝提取物中黃酮成分的含有量。

1.4.2 總多酚的測(cè)定 精密稱取沒食子酸0.10 g用60%乙醇完全溶解后定容至100 mL，用移液槍分別移取0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL 定容至 10 mL，分別取出 1 mL溶液置于10 mL具塞試管中，再分別加入5 mL超純水，1 mL福林試劑和7.5%Na2CO3溶液3 mL。充分混勻后在45℃下水浴1.5 h在765 nm處測(cè)吸光值。其線性方程為:Y=17.567X －0.0523;R2=0.9994，式中:X 為多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)，Y為吸光度。用60%乙醇將獨(dú)角蓮塊莖提取物配制成1 mg/mL溶液依照上述方法顯色后在765 nm處測(cè)吸光值，依據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚的質(zhì)量濃度，并計(jì)算出各工藝提取物中多酚成分的量。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化能力分析

2.1.1 DPPH自由基清除能力 試驗(yàn)中不同工藝獨(dú)角蓮塊莖提取物的自由基清除活性見圖1。圖1顯示:獨(dú)角蓮塊莖提取物對(duì)DPPH自由基有清除能力，并且在一定范圍內(nèi)呈質(zhì)量濃度依賴關(guān)系，清除率隨質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，熱回流和超聲兩種提取物對(duì)DPPH自由基的清除率均達(dá)到最大值，分別為90.34%和87.12%，而負(fù)壓空化提取物的清除率為80.07%。熱回流提取物、超聲提取物、負(fù)壓空化提取物對(duì)DPPH自由基的半清除率EC50見表1。

表1 獨(dú)角蓮塊莖提取物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力(n=3)

2.1.2 清除ABTS自由基的能力 熱回流提取物、超聲提取物、負(fù)壓空化提取物對(duì)ABTS自由基的總抗氧化能力與Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液比較所得的相對(duì)抗氧化能力見表1。

圖1、表1顯示，提取物的抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)闊峄亓魈崛∥铮境曁崛∥铮矩?fù)壓空化提取物。

2.2 獨(dú)角蓮塊莖提取物總黃酮和總多酚的測(cè)定 從表2中可以看出獨(dú)角蓮塊莖成分的提取效率為熱回流提?。境曁崛。矩?fù)壓空化提取;總黃酮量由高到低為熱回流提取物＞超聲提取物＞負(fù)壓空化提取物;總酚量由高到低為熱回流提取物＞負(fù)壓空化提取物＞超聲提取物。熱回流、超聲和負(fù)壓空化這3種提取物中，總黃酮和總多酚的總量分別約為34.82%、29.73%和31.14%。其中負(fù)壓空化提取對(duì)獨(dú)角蓮塊莖成分的提取率(6.46%)雖然很低，但是提取物中總黃酮和總酚的量還是很高的，約占總提取物的31.14%。

表2 不同工藝下獨(dú)角蓮塊莖提取物中總黃酮和總多酚的量

3 結(jié)論

醫(yī)學(xué)研究表明自由基及其代謝產(chǎn)物能夠誘發(fā)多種疾病，例如糖尿病、白內(nèi)障、炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病、癌癥等。已有研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的化學(xué)合成抗氧化劑具有一定的副作用和致癌性等缺點(diǎn)，不宜長(zhǎng)期使用［7］。而許多天然抗氧化劑能夠促進(jìn)體內(nèi)抗氧化酶與內(nèi)源性抗氧化劑的合成，有效清除體內(nèi)過多自由基，因此越來越多的學(xué)者關(guān)注天然抗氧化劑的研究［5-8］。獨(dú)角蓮作為一種傳統(tǒng)的中藥在免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等方面有廣泛的藥理作用［9］，但迄今為止，有關(guān)其抗氧化活性方面的研究還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過使用DPPH試劑和ABTS總抗氧化能力試劑盒分別對(duì)3種不同工藝的獨(dú)角蓮塊莖提取物進(jìn)行了抗氧化能力的測(cè)試，圖1和表1都可以看出3種獨(dú)角蓮塊莖提取物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基均具有清除活性，清除能力強(qiáng)弱順序均為熱回流提取物＞超聲提取物＞負(fù)壓空化提取物。

表2顯示:3種不同工藝的獨(dú)角蓮塊莖提取物的總黃酮和總多酚測(cè)定中，熱回流提取物的總黃酮和總酚量明顯高于超聲提取物和負(fù)壓空化提取物，這也印證了3種提取物中熱回流提取物的抗氧化活性最好的結(jié)論。超聲提取物的總黃酮量略高于負(fù)壓空化提取物的總黃酮量，而負(fù)壓空化提取物的總酚量微高于超聲提取物，結(jié)果與兩種提取方法的提取物的抗氧化能力相似。

3種不同提取方法中熱回流提取效率最高，并且熱回流提取物的抗氧化活性最好，提取物中總黃酮和總多酚的含有量也是最高的，這一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為今后獨(dú)角蓮抗氧化活性成分總黃酮及總酚的高效提取提供依據(jù)。

3種不同工藝的提取物的抗氧化能力不同，其原因可能是由于不同提取物中抗氧化成分組成和含有量不同，而且其中各物質(zhì)的協(xié)同作用可能不一致，導(dǎo)致了不同方法提取的獨(dú)角蓮塊莖提取物的抗氧化能力不同。其機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究，這也是今后研究的目標(biāo)。

本研究為利用獨(dú)角蓮塊莖開發(fā)天然抗氧化功效因子提供了依據(jù)，但由于是在體外進(jìn)行研究，而生物體內(nèi)的氧化代謝是很復(fù)雜的，因此，還有待于從生物體內(nèi)源抗氧化酶系活性和生物大分子氧化代謝產(chǎn)物水平的角度來進(jìn)一步研究獨(dú)角蓮塊莖的抗氧化作用機(jī)制。

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