魯振強，楊克科 ，馬龍彪，紀 巖，孟劍俠，劉麗萍，陳連江

（1.黑龍江省普通高等學校生化與分子生物學重點實驗室/黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱150080；2.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080）

甜菜（Beta vulgaris）是我國的主要糖料作物。然而，在甜菜的生產(chǎn)中，對幾乎所有的除草劑表現(xiàn)為高度敏感，危害程度相當嚴重；從播種、出苗到除草的幾個階段，生長都會受到除草劑的致命影響。隨著除草劑的大量應用，以及在土壤中的殘留，除草劑已成為甜菜生產(chǎn)的一大災害[1]。從遺傳上分析，這是甜菜的先天缺陷，只有通過導入外源的抗性基因，才能使甜菜產(chǎn)生對除草劑的抗性。

草甘膦（glyphosate），商品名農(nóng)達（Roundup），化學名稱為 N-（膦酸甲基）苷氨酸（N-phosphonomethylglycine），因其廣譜、高效等諸多優(yōu)點，是目前世界上使用最廣泛的除草劑。5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPs，EC 2.5.1.19）在植物中廣泛存在，該酶是芳香族氨基酸生物合成過程中的一個關鍵酶，在莽草酸途徑中催化磷酸烯醇式丙酮酸 （phosphoenolpyruvate；PEP）和3-磷酸莽草酸（shikimate-3-phosphate；S3P）合成5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate；EPSP），草甘膦的除草機理就是抑制EPSPs，使芳香族氨基酸缺乏，對植物細胞分裂、葉綠素合成、蒸騰、呼吸以及蛋白質等代謝過程產(chǎn)生影響，從而擾亂生物體的正常代謝使其死亡[2－3]。

基于此，本研究以提高甜菜對草甘膦除草劑的抗性為研究目標，采用RT-PCR技術對抗性基因EPSPs的功能域進行了克隆，并且確認獲得了目的基因。這為后期構建超表達EPSPs植物表達載體，對甜菜進行遺傳轉化，最終獲得抗草甘膦的甜菜材料奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與主要試劑

選用Ecotype Colombia型Arabidopsis thaliana為靶基因克隆的植物材料。BIOZOL（BioFlux）、pMD18-T載體、膠回收試劑盒（TaKaRa）；大腸桿菌DH5α（本實驗室）；RNA電泳所用試劑均為進口分析純。

1.2 總RNA的提取與檢測

稱取1g植物幼嫩葉片組織，加入5mL BIOZOL試劑中，室溫溫育15min；離心；將上層清液中加入1/5體積的氯仿，冰浴15 min；再次離心，將上層清液中加入等體積異丙醇，于-20℃放置30min；離心后，將沉淀于1mL 70%乙醇中洗滌兩次，晾干后，溶于DEPC水中，儲存于-70℃?zhèn)溆?。利用紫外分光光度計，分別在OD260和OD280條件下測定RNA的含量和純度，并將樣品的濃度稀釋成1μg/μL備用。取2μg總RNA，加入15.8μL變性液，電泳緩沖液為1×MOPs，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，進一步確定RNA質量。

1.3 引物設計

根據(jù)AtEPSPs基因的序列（GenBank No.NM_202267.1）信息，利用Primer premier 5.0設計上游引物（5'-3'）：CGGGA TCCCG ATGCT AAAT；下游引物（5'-3'）：CGAGC TCGTT AATGC TTTGT G，擴增 AtEPSPs 基因的CDS功能域長度為1470 bp。擴增引物由上海生工合成。

1.4 RT-PCR

在12μL的反應體系中加入3μg RNA、10μM Oligo dT以及RNase free H2O于65℃反應5min，并立即置于冰上；向第一步變性反應液中加入5×RT Buffer，20mM dNTPs，10U RNase Inhibiter以及20U的Rever Tra Ace（ToYoBo），總體積為 20μL。 反應條件為 42℃ 60min；99℃ 5min；4℃ 5min。 將產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR 擴增：50μL 的反應體系中， 分別加入 2μL cDNA 模板，5μL 10×Taq Buffer、4μL 10mM dNTPs、1μL 20μM 上游引物和下游引物，0.5μL rTaq （TaKaRa）。 PCR 擴增條件為：94℃預變性 5min；94℃（30s），52℃（45s），72℃（3min），30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，并利用GeneSnap 6.08（f）進行檢測。

1.5 酶切驗證及序列測定

將擴增產(chǎn)物進行電泳，回收；將pMD18-T載體和AtEPSPs回收片段按照摩爾比1∶5進行連接，轉化到DH5α感受態(tài)細胞中，通過Amp抗性及藍白斑篩選出待測陽性克隆。待測陽性克隆經(jīng)過提質粒，酶切鑒定，最終進行測序驗證。

圖1 AtEPSPs基因CDS功能域的RT-PCR擴增

2 結果與分析

2.1 抗草甘膦AtEPSPs基因的克隆

實驗以Ecotype Colombia型Arabidopsis thaliana為靶基因克隆的植物材料，利用BIOZOL試劑提取了總RNA（圖1A）。電泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外燈下清晰可見，并且，28S rRNA的亮度是18S rRNA的2倍左右，這說明RNA基本上沒有被降解，且無彌散。同時，加樣孔附近沒有雜帶，說明產(chǎn)物中沒有DNA存在；在18S rRNA下方存在一些較為模糊的條帶，這可能是由tRNA，5.8S RNA和5S rRNA組成的遷移較快的條帶。這些結果都說明了實驗獲得了較高純度和得率的總RNA。

以總RNA為模板，利用逆轉錄酶成功獲得了cDNAs。通過RT-PCR擴增，實驗在1.47kb的位置獲得了目的片斷（圖1B）。這與AtEPSPs基因的序列（GenBank No.NM_202267.1）的功能域的大小1.47 kb相一致。

圖2 pMD 18-T-AtEPSPs載體的構建

2.2 測序載體pMD 18-T-AtEPSPs質粒的構建

將PCR獲得的AtEPSPs基因片段進行回收，與pMD 18-T連接，并轉化到DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含有 Amp、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基上。挑取白斑陽性克隆，并對應提取質粒DNA。首先通過對AtEPSPs基因序列的限制性內切酶分析，選取在AtEPSPs基因的EcoRI酶切位點處來對重組質粒進行酶切鑒定；該限制性內切酶在T載體上也有一個酶切位點。

如圖2A所示，經(jīng)過EcoRI酶切重組質粒，獲得了兩條位于4.044kb和0.144kb左右位置的條帶，以及獲得了兩條位于2.838kb和1.35kb左右位置的條帶，分別與預計相符。片段的總長為4.19kb左右，這與T載體（2.69kb）和AtEPSPs全長（1.47kb）加起來的總長基本一致；在確認靶基因的正確性下，也進一步明確了目的基因在T載體上的插入方向，根據(jù)EcoRI在AtEPSPs基因內部以及T載體上的位置，可以確定AtEPSPs基因分別是正向（圖2A中的泳道1）、逆向（圖2A中的泳道2）插入到T載體上的。另外，采用PCR擴增對這兩類陽性質粒載體進行了鑒定，結果如圖2B所示，與預期結果相符。并進行了測序鑒定。

3 討論

本研究采用RT-PCR技術獲得了草甘膦除草劑抗性基因EPSPs的功能域序列，經(jīng)過分子鑒定獲得了確認。這為后續(xù)進行甜菜轉基因研究、獲得甜菜抗除草劑轉基因材料奠定了堅實的基礎。迄今為止，雖然美國等抗除草劑甜菜品種已研制成功，但其申請專利保護，輸入并控制了包括中國在內的許多國家甜菜抗除草劑商用品種的價格，已形成了壟斷[4]。所以，本研究對抗草甘膦除草劑基因的克隆，不僅可以打破國外的壟斷，開發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權的抗除草劑甜菜品種，實現(xiàn)我國甜菜生產(chǎn)對品種的自主性，具有重大理論價值。而且，更為重要的是對推動甜菜生產(chǎn)，提高甜菜產(chǎn)量，增加農(nóng)民收入，促進經(jīng)濟發(fā)展具有重要的科學意義。

[1]李玉萍.基因工程在甜菜育種中的研究現(xiàn)狀[J].河北農(nóng)業(yè)科學，2009，13（2）：55-57.

[2]Cerdeira A L，Duke S O.The current status and environmental impacts of glyphosate-resistant crops：a review[J].J Environ Qual，2006，35：1633-1658.

[3]Gerald M D.Glyphosate-resistant crops：history，status and future[J].Pest Manag Sci.，2005，61：219-244.

[4]James C.Global status of commercialized biotech/GM Crops[M]：2008.NY：ISAAA，2009.