肖建,于倩,范露丹,姚利民,盧川,馬韻,曾麗霞,李運(yùn)千,黃永秩,黃小英,黃炳臣,姚金光,黃照權(quán),龍喜帶②

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院2009級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè),廣西 百色 533000 E-mail:xiaojianty@sina.cn;2.右江民族醫(yī)學(xué)院2008級醫(yī)學(xué)影像學(xué)專業(yè),廣西 百色 533000;3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科,廣西 南寧 530027;4.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科,廣西 南寧 530023;5.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科,廣西 桂林 541000;6.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國一種多發(fā)的惡性腫瘤[1],如何有效地利用該腫瘤組織標(biāo)本(尤其是石蠟包埋組織)構(gòu)建HCC基因組DNA是HCC研究領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。近年來,國內(nèi)的一些研究者對于如何充分利用石蠟包埋組織做了一些有意義的探討,但結(jié)果并不是很理想[2～5]。在本次研究中,筆者采用改良組織裂解法提取石蠟包埋HCC腫瘤組織的基因組DNA,構(gòu)建了相應(yīng)基因組DNA文庫,具體如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為保證文庫構(gòu)建的質(zhì)量,本研究按圖1所示路線開展相關(guān)研究工作。

圖1 HCC腫瘤組織標(biāo)本基因組DNA文庫構(gòu)建實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖

1.2 主要試劑與材料

1.2.1 主要試劑 TO型生物制片透明劑(TO,廣西岑溪松香廠研制)、無水乙醇(上海生工)、組織裂解改良法DNA提取試劑盒(含組織裂解液、蛋白漂洗液Ⅰ和Ⅱ、蛋白酶K及DNA溶解液。委托康為世紀(jì)生物科技有限公司合成該試制,試劑盒編號:CW0547)。

1.2.2 主要儀器設(shè)備 SmartSpecTM核酸蛋白測量儀(BIORAD)、勻漿機(jī)(PRO Scientific Inc.)、臺式高速離心機(jī)(Sigma)、實(shí)時(shí)定量PCR儀(BIO-RAD)、DYY-6C型電泳儀及Chemic-DocXRS成像系統(tǒng)(BIO-RAD)、DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、移液槍(Eppendorf)、離心管(Axy-Gen)、96孔PCR反應(yīng)板(AxyGen)、DNA保存管(AxyGen)及移液槍頭(AxyGen)等。

1.3 研究標(biāo)本入選標(biāo)準(zhǔn)的確定 根據(jù)構(gòu)建基因組文庫及開展HCC研究的基本要求,本研究標(biāo)本的入選標(biāo)準(zhǔn)如下:①所有研究標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為HCC標(biāo)本;②通過查閱病歷或隨訪調(diào)查能獲取完整的臨床資料及生存資料;③能獲取到足夠的石蠟包埋腫瘤組織標(biāo)本;④能獲得病人本人或家屬的知情同意。

1.4 基因組DNA的提取 采用組織裂解改良法提取HCC腫瘤組織標(biāo)本基因組DNA,具體步驟如下:①取1cm×1cm大小的石蠟包埋HCC腫瘤組織標(biāo)本厚約 40μ m,入TO型透明劑脫蠟3次,每次 30min;②將脫蠟后的組織入無水乙醇2次,每次20min;③揮干乙醇,將組織移入1.5ml的離心管;④加入280μl組織裂解液,經(jīng)勻漿器充分勻漿;⑤加入 400μg蛋白酶 K,顛倒混勻后置 56℃水浴箱水浴 60min、隨之 90℃水浴箱水浴60min;⑥水浴后加入 560μl DNA促沉液,顛倒混勻后移入DNA吸附管,經(jīng)離心后棄廢液;⑦向吸附管中加入500μl蛋白漂洗液Ⅰ,經(jīng)離心棄廢液后加入 500μl蛋白漂洗液Ⅱ,離心棄廢液;⑧置室溫自然風(fēng)干吸附管中的殘液后,加入DNA溶解液100μl,室溫靜置 2min,隨之離心并收集漏液用于質(zhì)量鑒定或置于-20℃保存用于構(gòu)建文庫。

1.5 質(zhì)量的監(jiān)控與鑒定

1.5.1 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的監(jiān)控 所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)立陽性對照、陰性對照及空白對照以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的監(jiān)控;此外,為有效監(jiān)控文庫構(gòu)建過程中的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量,我們設(shè)立了對照組(n=100),通過經(jīng)典酚氯DNA提取法抽提所有對照人群的外周血白細(xì)胞基因組DNA,用于后續(xù)文庫質(zhì)量的鑒定。

1.5.2 DNA濃度及純度的鑒定 通過SmartSpecTM核酸蛋白測量儀分析所獲取的基因組DNA濃度及純度,以DNA濃度≥0.1μg/μl合格濃度標(biāo)本;以A260/A280比值介于 1.6～ 2.0為合格純度標(biāo)本。

1.5.3 DNA模板質(zhì)量的鑒定 由于所提取的HCC組織基因組DNA文庫主要用于HCC發(fā)病機(jī)制及臨床預(yù)后的研究,因此應(yīng)當(dāng)對充當(dāng)模板的質(zhì)量進(jìn)行鑒定,筆者通過PCR及瓊脂糖凝膠電泳方法來鑒定這種質(zhì)量。①PCR鑒定方法采用XPF基因作為實(shí)驗(yàn)基因,通過TaqMan-MGB-PCR技術(shù)來驗(yàn)證,具體實(shí)驗(yàn)方法參見我們發(fā)表在“Hepatology”的論文[6],實(shí)驗(yàn)合格判斷方法如下:采用BIO-RAD隨機(jī)軟件IQ5分析,如果所獲得的實(shí)時(shí)曲線為單一光滑曲線即表明DNA模板質(zhì)量較好;②瓊脂糖凝膠電泳鑒定方法采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定,取PCR產(chǎn)物8μl在120V電流下電泳30min后通過Bio-Rad凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察質(zhì)量鑒定結(jié)果,合格判斷方法如下:DNA條帶單一并清晰,無明顯拖尾現(xiàn)象。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本收集情況 根據(jù)構(gòu)建HCC腫瘤組織標(biāo)本基因組DNA文庫的樣本入選標(biāo)準(zhǔn),我們從廣西醫(yī)科大學(xué)、桂林醫(yī)學(xué)院及右江民族醫(yī)學(xué)院三所醫(yī)學(xué)院校的附屬醫(yī)院收集到組織標(biāo)本共2245例,均是經(jīng)組織病理診斷方法確診為HCC的石蠟包埋腫瘤組織標(biāo)本,組織標(biāo)本質(zhì)量好,標(biāo)本面積及厚度符合要求;其中137例臨床資料或生存隨訪資料不齊而被排除,因此本研究共收集到合格標(biāo)本2108例。

2.2 基因組文庫構(gòu)建情況 通過組織裂解改良法對所有合格組織標(biāo)本進(jìn)行了基因組DNA的抽提,通過Microsoft excel 2003建立了相應(yīng)HCC腫瘤組織基因組DNA文庫,文庫主要內(nèi)容包括:文庫對象姓名、性別、年齡、民族、籍貫、生活工作地、遷移史、煙酒史、家庭腫瘤史、肝炎病毒感染史、黃曲霉毒素B1暴露史、HCC臨床病理特征、治療史、生存情況等,所有標(biāo)本在文庫中均具有唯一序列號。

2.3 基因組文庫質(zhì)量評估情況 我們對所構(gòu)建的基因組DNA文庫中的DNA樣本進(jìn)行了濃度及純度的檢測,所提取的DNA濃度均大于或接近 0.1μg/μl,而反映 DNA純度的OD260/280值都在1.6～2.0之間,提示本文庫DNA的濃度及純度均達(dá)到了組織基因組DNA文庫的基本要求;為進(jìn)一步分析DNA作為研究模板的質(zhì)量,我們通過TaqMan-MGB-PCR方式對其進(jìn)行了鑒定(見圖2),PCR實(shí)時(shí)定量曲線結(jié)果顯示波峰單一,曲線運(yùn)行光滑(見圖2A),基因分型結(jié)果顯示分簇界線清楚(見圖2B),t檢驗(yàn)結(jié)果顯示在文庫基因組DNA與對照組DNA兩者間的熒光定量差異無顯著性(P＞0.05);通過瓊脂糖凝膠電泳方式鑒定發(fā)現(xiàn)DNA條帶單一清晰,無明顯拖尾現(xiàn)象(見圖3),定量分析顯示文庫基因組DNA與對照組DNA兩者間的差異無顯著性(P＞0.05),提示本文庫DNA質(zhì)量較好,可用于后續(xù)的研究工作。

圖2 TaqMan-MGB-PCR鑒定基因組DNA文庫質(zhì)量,實(shí)驗(yàn)基因?yàn)閄PF,圖A為PCR的實(shí)時(shí)定量曲線圖,圖B為XPF的基因分型圖,其中“基因型1”、“基因型 2”及“基因型3”其對應(yīng)的DNA模板來自文庫DNA,陽性對照對應(yīng)的DNA模板來自對照組DNA,陰性對照為缺乏DNA模板的監(jiān)控對照。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因組DNA文庫質(zhì)量,實(shí)驗(yàn)基因?yàn)閄PF,圖中“M”為電泳 DNA Marker,“1～ 4”來自基因組 DNA 文庫 DNA,“5～ 8”來自對照組 DNA。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)的目的是通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建可用于HCC研究的腫瘤組織標(biāo)本基因組DNA文庫,通過實(shí)驗(yàn),我們成功地構(gòu)建了高質(zhì)量的HCC腫瘤組織基因組DNA文庫,其成果的主要經(jīng)驗(yàn)如下:第一,我們進(jìn)行了嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),明確了基因組DNA文庫構(gòu)建的目的及用途;第二,研究人員進(jìn)行有效的分組合作,嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的操作規(guī)程開展相關(guān)研究工作;第三,明確了研究標(biāo)本的入選條件,我們對不符合入選條件的標(biāo)本進(jìn)行了剔除,從而有效地保證了實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量;第四,我們在酚氯抽提法提取基因組DNA的基礎(chǔ)上,對石蠟包埋腫瘤組織的基因組DNA提取試劑進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn),用低毒性的TO型生物制片透明劑代替了毒性較高的二甲苯進(jìn)行脫蠟[7],在脫蠟前將組織適當(dāng)加熱以促進(jìn)徹底脫蠟;第五,對消化裂解步驟進(jìn)行了有效的優(yōu)化,鑒于肝腫瘤組織標(biāo)本中纖維較少而腫瘤細(xì)胞較多的原因,根據(jù)組織的量適當(dāng)增加了裂解液的濃度及使用量,并通過高速電動(dòng)勻漿器對標(biāo)本進(jìn)行了徹底勻漿以利于蛋白酶K的消化作用;第六,為保證所提取的基因組DNA的純度,主要是為防止蛋白的污染,我們一方面通過蛋白酶K的消化作用來裂解組織蛋白,另一方面通過含異丙醇的蛋白漂洗液對DNA標(biāo)本進(jìn)行清洗以利于去除蛋白污染;最后,科學(xué)地進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的監(jiān)控。在當(dāng)前研究中,我們通過文庫構(gòu)建前的監(jiān)控設(shè)計(jì)、文庫構(gòu)建中的控制對照及文庫構(gòu)建后的質(zhì)量檢測等三個(gè)環(huán)節(jié)有效地保證了實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。

總之,通過合理科學(xué)的設(shè)計(jì)、嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)及有效的質(zhì)量監(jiān)控可以利用石蠟包埋組織構(gòu)建用于HCC研究的腫瘤組織基因組DNA文庫。

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