王 芳 尹利榮 孫 蓓

人類的機(jī)體時(shí)刻被來自外在和內(nèi)在的多種微生物圍攻，先天免疫系統(tǒng)可以抵抗一些潛在的病原體，這類具有抗菌活性的肽和微量蛋白的產(chǎn)物統(tǒng)稱為抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs），AMPs是宿主先天免疫的一部分[1]。女性下生殖道為開放性腔道，當(dāng)受到內(nèi)源或外源性因素影響時(shí)，以乳桿菌等優(yōu)勢(shì)菌為主要組成的微生態(tài)系統(tǒng)很容易發(fā)生改變，導(dǎo)致疾病的發(fā)生[2]。本研究通過構(gòu)建AMPs中防御素5（HD5）和LL37的真核重組質(zhì)粒，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人陰道上皮細(xì)胞，以期探討陰道上皮細(xì)胞抵抗微生物感染的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 pcDNA3.1（+）表達(dá)質(zhì)粒購自Invitrogen公司；pcDNA3.1（+）-EGFP表達(dá)質(zhì)粒由天津醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所構(gòu)建；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、KpnⅠ、NotⅠ購自TaKaRa公司；KOD dash酶購自TOYOBA公司；pGEM-T Easy載體、質(zhì)粒抽提試劑盒、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶及RNA酶抑制劑為Promega公司產(chǎn)品；Oligo（dT）18購自上海生工生物工程有限公司；Trizol和細(xì)胞轉(zhuǎn)染用Lipofectamine 2000試劑盒購自Invitrogen公司；氨芐青霉素、卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）購自華美生物工程公司；β-巰基乙醇、瓊脂糖、甘氨酸、溴化乙錠（EB）為美國Sigma公司產(chǎn)品；酵母提取物（Yeast Extract）、胰蛋白胨（Tryptone）、瓊脂（Agar）、角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（K-SFM）、胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基均為GIBCO公司產(chǎn)品。DNA快速純化回收試劑盒，高純質(zhì)粒提取試劑盒均購自Biomega生物技術(shù)公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自PIERCE公司。大腸桿菌E.coli JM109菌株為天津醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所保存。人HD5定量酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒最小可測(cè)濃度為0.1 μg/L，人LL37定量ELISA試劑盒最小可測(cè)濃度為0.14 μg/L，以上2種試劑盒均購自瑞科生物技術(shù)有限公司。GeneAmp PCR System 9600擴(kuò)增儀為美國Perkin Elmer Cetus公司產(chǎn)品。

1.2 重組pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP及pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 提取陰道總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，組織提供者均鑒署知情同意書。采用Trizol試劑一步法提取健康育齡女性陰道黏膜上皮細(xì)胞（細(xì)胞取自我院婦科門診體檢女性）的總RNA，經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。在不同波長(zhǎng)下檢測(cè)電泳條帶的光密度（OD）值，若OD260/OD280介于1.8~2.0，OD260/OD230介于1.5~1.9，說明RNA純度較高。然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 擴(kuò)增獲編碼HD5和LL37成熟肽的DNA序列 PCR引物根據(jù)Gene Bank核酸數(shù)據(jù)庫應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)，委托北京奧科生物公司合成。并在引物的兩端加入限制性內(nèi)切酶的酶切序列。引物序列為：HD5-正義5′-CGGGGTACC ATGAGGACCATCGCC-3′；HD5-反義5′-ATAAGAATGCGG CCGCGCGACAGCAGAGTCTG-3′。LL37-正義5′-CGGGGT ACCATGAAGACCCAAAG-3′；LL37-反義 5′-ATAAGAATGC?GGCCGCGGACTCTGTCCTGG-3′。GGTACC為KpnⅠ的酶切位點(diǎn)，GCGGCCGC為NotⅠ的酶切位點(diǎn)。PCR條件：以cDNA為模板，預(yù)變性95℃5 min，隨后按94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s。35次循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸5 min，最后加入1U普通Taq DNA聚合酶72℃反應(yīng)1 h。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 目的基因轉(zhuǎn)入pGEM-T Easy載體 用DNA快速純化回收試劑盒按使用說明進(jìn)行操作，將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。將目的基因與pGEM-T載體連接，反應(yīng)體系為：pGEM-T載體1 μL；T4 DNA連接酶1 μL；2×Ligase Buffer 5 μL；PCR回收產(chǎn)物3 μL，共計(jì)10 μL。加入離心管，4℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliJM109，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取陽性菌落，培養(yǎng)后進(jìn)行PCR檢測(cè)。檢測(cè)為陽性者，將菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。

1.2.4 構(gòu)建 pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP和 pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP真核重組質(zhì)粒 含有目的基因的克隆載體和pcDNA3.1（+）質(zhì)粒分別用內(nèi)切酶KpnⅠ、NotⅠ雙酶切過夜（37℃）。將酶切后分別回收的基因片段和pcDNA3.1(+)質(zhì)?；旌希尤隩4 DNA連接酶，置于16℃水浴中連接過夜。10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109 100 μL（方法同前），涂布于LB平板培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，挑選單個(gè)菌落，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行PCR檢測(cè)。檢測(cè)為陽性者，將菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。

1.2.5 重組質(zhì)粒的酶切鑒定和序列分析 將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ酶切鑒定，反應(yīng)體系為：重組質(zhì)粒DNA 3 μL，10×Buffer 2 μL，內(nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ各0.5 μL，加去離子水4 μL，37℃酶切過夜。陽性重組質(zhì)粒由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.3 人陰道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代 人陰道上皮細(xì)胞取材于因子宮肌瘤或子宮腺肌病行全子宮切除的育齡期患者陰道壁組織。術(shù)前宮頸細(xì)胞學(xué)檢查無異常，抗感染篩查為陰性，術(shù)后病理檢查為良性疾病。參考吳文湘等[3]的方法采用K-SFM和組織塊法進(jìn)行陰道上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)，將新鮮陰道組織放入加有抗生素（慶大霉素50 μg/L，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL）的4℃D.Hank’s液無菌小瓶?jī)?nèi)。經(jīng)消毒、分離后將組織碎塊接種于一次性培養(yǎng)瓶中，加入含抗生素的K-SFM培養(yǎng)基（兩性霉素B 0.25 mg/L，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL），在37℃，6%CO2孵育箱中培養(yǎng)。當(dāng)上皮細(xì)胞接近90%以上融合時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的胰蛋白酶/質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的乙二胺四乙酸消化液按體積比1∶2或1∶3進(jìn)行傳代，傳至第4代準(zhǔn)備試驗(yàn)。苔盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.4 AMPs真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陰道上皮細(xì)胞 以0.5×105的密度將細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入500 μL無抗生素K-SFM培養(yǎng)基至細(xì)胞融合率達(dá)80%~90%時(shí)，分別將質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-EGFP、pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP及pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP與Lipofectamine2000混合后按轉(zhuǎn)染試劑盒的操作說明轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP為HD5組、轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP為L(zhǎng)L37組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP和pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP為聯(lián)合轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞為未轉(zhuǎn)染組，同時(shí)設(shè)置一空載質(zhì)粒為空白對(duì)照組。每孔設(shè)2個(gè)復(fù)孔。

1.5 抗菌肽LL37及HD5表達(dá)情況檢測(cè) 分別于轉(zhuǎn)染后6、12、24及48 h用熒光顯微鏡觀察真核重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染陰道上皮細(xì)胞情況，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍存于-80℃，收齊標(biāo)本后用ELISA方法檢測(cè)LL37及HD5含量，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料結(jié)果以±s表示。多組各時(shí)點(diǎn)HD5、LL37值的比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP 和 pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 人陰道上皮細(xì)胞總RNA的提取 經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，28 s與18 s的密度比值約為2，總RNA的完整性較好，基本無降解，見圖1。

Figure 1 Electrophoresis of RNA in denaturing formaldehyde agarose gels圖1 RNA甲醛變性電泳圖

2.1.2 人HD5和LL37基因的獲取 以cDNA為模板，分別擴(kuò)增出產(chǎn)物長(zhǎng)度約為307 bp的HD5和538 bp的LL37成熟肽編碼序列，見圖2。

Figure 2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.1.3 真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP及pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP的酶切鑒定 經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ對(duì)重組質(zhì)粒酶切可見約307 bp、538 bp左右2條片段，經(jīng)測(cè)序證實(shí)其結(jié)果與GenBank上報(bào)道的HD5cDNA和LL37cDNA序列完全一致，目的基因全已連入pcDNA3.1（+）-EGFP載體，序列完全正確，讀碼框架正確，質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖3。

Figure 3 Identification of the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP and pcDNA3.1(+)/LL37-EGFP圖 3 pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP和pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.2 人陰道上皮原代培養(yǎng)的細(xì)胞特點(diǎn)、活性及純度鑒定 陰道上皮組織接種后4~6 d，從小組織塊周邊可見生長(zhǎng)出來的陰道上皮原代細(xì)胞呈多角形，如鋪路石狀，細(xì)胞體積較小，大小均一，胞質(zhì)均勻明亮，輪廓清晰光滑，折光性強(qiáng)，倒置相差顯微鏡下有立體感。上皮細(xì)胞逐漸生長(zhǎng)融合成片，原代培養(yǎng)10 d左右細(xì)胞融合。每代細(xì)胞生長(zhǎng)至85%~90%融合時(shí)傳代。第3~6代細(xì)胞形態(tài)良好，與原代無明顯區(qū)別，是細(xì)胞生長(zhǎng)的黃金時(shí)期，細(xì)胞傳代的貼壁率明顯提高，在增殖期間細(xì)胞核分裂象多見，見圖4。傳代至第3代即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。苔盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力可達(dá)90%~95%，顯微鏡下計(jì)數(shù)上皮細(xì)胞純度達(dá)99%以上。

Figure 4 The growth status of cultured primary human vaginal epithelial cells(×10)圖4 原代培養(yǎng)的陰道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)情況（×10）

2.3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP及pcDNA 3.1（+）/LL37-EGFP的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率及目的基因的表達(dá)

2.3.1 陰道上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況 在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞膜和胞內(nèi)有較強(qiáng)的綠色熒光，且轉(zhuǎn)染細(xì)胞陽性率近100%，24 h時(shí)轉(zhuǎn)染率最高，見圖5。

Figure 5 The LL37 and HD5 gene expression of human vaginal epithelial cells after transfection of recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/LL37-EGFP(A)and pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP(B)for 24 hours（×20）圖5 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP（A）和pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP（B）時(shí)陰道上皮細(xì)胞LL37和HD5的基因表達(dá)（×20）

2.3.2 各組細(xì)胞不同時(shí)段LL37及HD5的表達(dá)水平 同一時(shí)段各組組間LL37水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=849.138，P<0.001）。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組高于LL37組，LL37組高于未轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001）。組內(nèi)不同時(shí)間LL37水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=3 410.030，P<0.001），除未轉(zhuǎn)染組外，其他2組均是6 h時(shí)分泌最低，24 h達(dá)高峰，然后呈下降趨勢(shì)。組間和處理時(shí)間之間存在交互效應(yīng)（F交互=13 211.408，P<0.001），見表1。同一時(shí)段各組組間HD5水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=609.262，P<0.001）。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組高于HD5組，HD5組高于未轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001）。組內(nèi)不同時(shí)間HD5水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=1 086.068，P<0.001），HD5組隨時(shí)間增加，HD5水平呈增加趨勢(shì)；聯(lián)合轉(zhuǎn)染組6 h時(shí)分泌最低，24 h達(dá)高峰，然后呈下降趨勢(shì)。組間和處理時(shí)間之間存在交互效應(yīng)（F交互=6 130.852，P<0.001），見表2。

Table 1 Comparison of LL37 levels in different time points between three groups表1 不同時(shí)段各組LL37水平比較 （μg/L ±s）

Table 1 Comparison of LL37 levels in different time points between three groups表1 不同時(shí)段各組LL37水平比較 （μg/L ±s）

F組間=849.138**，F(xiàn)時(shí)間=3 410.030**，F(xiàn)交互=13 211.408**；**P<0.001

組別未轉(zhuǎn)染組LL37組聯(lián)合轉(zhuǎn)染組F 6 h 0.69±0.06 17.34±0.26 19.34±0.58 2 293.884**12 h 0.69±0.03 36.62±1.02 37.82±0.67 2 711.096**24 h 0.81±0.04 63.34±1.05 64.49±0.68 7 625.269**48 h 0.70±0.02 23.51±0.97 25.20±1.03 839.727**F 9.730 1 492.582**1 998.456**

Table 2 Comparison of HD5 levels in different time points between three groups表2 不同時(shí)段各組HD5水平比較 （mg/L， ±s）

Table 2 Comparison of HD5 levels in different time points between three groups表2 不同時(shí)段各組HD5水平比較 （mg/L， ±s）

F組間 =609.262**，F(xiàn)時(shí)間 =1 086.068**，F(xiàn)交互 =6 130.852**；**P<0.001

組別未轉(zhuǎn)染組HD5組聯(lián)合轉(zhuǎn)染組F 6 h 1.17±0.04 8.22±0.30 17.10±0.14 5 031.095**12 h 1.12±0.08 12.02±0.61 28.01±1.26 835.694**24 h 1.10±0.03 14.94±0.42 50.07±1.19 3 592.806**48 h 1.11±0.04 16.94±0.42 37.76±0.41 8 784.427**F 2.145 238.871**917.759**

3 討論

人體上皮細(xì)胞可產(chǎn)生3大類AMPs，包括防御素、Cathelicidins和富組蛋白。防御素是一種兼兩性的陽離子多肽，HD5屬于防御素α亞家族，除了由人腸道潘氏細(xì)胞分泌，HD5也可在雌性生殖道復(fù)層上皮細(xì)胞表達(dá)，包括陰道、子宮頸、子宮內(nèi)膜和輸卵管，在胎盤和胎膜中也有HD5存在[4]。Dürr等[5]觀察到女性生殖道不同位置都有HD5的表達(dá)，并且在陰道沖洗液中檢測(cè)到高濃度的HD5。人源性陽離子抗菌肽-18（hCAP-18）是Cathelicidins家族中唯一存在于人體的AMPs，hCAP-18經(jīng)絲氨酸蛋白酶3裂解產(chǎn)生LL37。LL-37由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及各種不同的上皮細(xì)胞產(chǎn)生。

AMPs抗致病原微生物種類廣泛，包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、寄生蟲、包膜病毒，甚至非微生物類的腫瘤細(xì)胞[6]。這些天然分子殺滅多重耐藥微生物的能力已得到相當(dāng)重視和臨床關(guān)注[1]。AMPs的作用機(jī)制是通過肽-膜質(zhì)作用攻擊靶細(xì)胞膜形成離子通道，使細(xì)胞內(nèi)容物外滲而殺菌，可有效殺滅病原體[7]。作為一種陽離子小肽，AMPs以其高效、廣譜、抗菌機(jī)制獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)，日益成為最具開發(fā)前景的新型抗菌藥物。但從天然資源中提取AMPs成本高、獲得率低、工序繁瑣；化學(xué)合成則價(jià)格昂貴，也難以應(yīng)用于臨床，這成為AMPs開發(fā)的瓶頸，因此利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)AMPs具有重要意義和廣闊前景。

AMPs出現(xiàn)在人體所有接觸微生物的部位如皮膚和黏膜，多由感染或損傷導(dǎo)致[8]。女性陰道是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，是由多種微生物構(gòu)成的動(dòng)態(tài)平衡體系[2]。陰道微生態(tài)平衡一旦被破壞,如菌群失調(diào)、免疫功能低下、大量使用抗生素等，陰道上皮細(xì)胞可以合成AMPs抵御病原體。研究發(fā)現(xiàn)陰道內(nèi)HD5水平在不同的感染狀態(tài)下均有明顯升高[9]，提示了先天性免疫因子HD5參與了下生殖道感染的發(fā)病過程。Valore等[10]研究顯示正常對(duì)照組陰道灌洗液中HD5的水平范圍為10~40 μg/L。這些宮頸陰道分泌物的成分隨著月經(jīng)周期、雌激素治療及感染情況而改變[11]。然而天然合成的量有限，往往不足以抵御病原體感染而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。通過人工方法增加AMPs的分泌，為增強(qiáng)陰道上皮細(xì)胞抗菌性進(jìn)行基因干預(yù)是本實(shí)驗(yàn)的目的。

本研究24 h轉(zhuǎn)染細(xì)胞陽性率近100%，熒光顯微鏡下可見大量綠色熒光，證明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP 及 pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP轉(zhuǎn)染陰道上皮細(xì)胞。細(xì)胞上清液結(jié)果證明，抗菌肽LL-37及HD5能夠在陰道上皮細(xì)胞中表達(dá)，陰道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP或（和）pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP質(zhì)粒后，LL37及HD5分泌水平均顯著高于未轉(zhuǎn)染組，且聯(lián)合轉(zhuǎn)染高于單獨(dú)轉(zhuǎn)染組，說明LL37及HD5的分泌具有協(xié)同促進(jìn)作用。未轉(zhuǎn)染組不同時(shí)段的LL3及HD5均保持在低水平穩(wěn)定狀態(tài)，證實(shí)陰道上皮細(xì)胞在自然狀態(tài)下有一定量AMPs分泌，但這種分泌是一種持續(xù)的低水平狀態(tài)。人工轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后陰道上皮細(xì)胞分泌AMPs的量明顯增加，分泌量在24 h達(dá)峰值。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，基因轉(zhuǎn)染效率開始降低，推測(cè)可能與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染本身的特點(diǎn)有關(guān)，也可能是重組基因引起了陰道上皮細(xì)胞凋亡。

有研究發(fā)現(xiàn)HD5及LL37不僅對(duì)病原體有直接的抵抗作用，而且具有調(diào)節(jié)宿主免疫功能的作用，HD5可以誘導(dǎo)結(jié)腸細(xì)胞系分泌IL-8[12]。LL37也可刺激髓細(xì)胞及上皮細(xì)胞的細(xì)胞因子尤其是IL-8的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)炎癥感染部位中性粒細(xì)胞的宿主防御功能[13]。HD5及LL37的表達(dá)增加能否同時(shí)刺激陰道上皮細(xì)胞炎性趨化因子的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。

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