劉馨蓮 殷 舞 李 欣

細(xì)胞分子生物學(xué)研究認(rèn)為，腫瘤的本質(zhì)在于細(xì)胞周期的調(diào)控紊亂，細(xì)胞呈現(xiàn)失控性生長和凋亡減少[1]。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程，正常細(xì)胞周期是指正常連續(xù)分裂的細(xì)胞從前一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的連續(xù)動(dòng)態(tài)過程。主要分為4期：G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（有絲分裂期）。隨著正常細(xì)胞周期和腫瘤細(xì)胞周期的深入研究，許多學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞生長周期的失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，且對(duì)腫瘤的惡性生物學(xué)行為及腫瘤的預(yù)后有重要意義[2-4]。本研究主要探討細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）D1、Cyclin A、Cyclin B1和核分裂特異性抗體（PHH3），分別代表G1期、S期、G2期和M期在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特征和規(guī)律，以期為腦膠質(zhì)瘤的早期診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2003年9月—2008年2月廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本59例。其中男31例，女28例，年齡4~73歲，平均（46.2±19.6）歲。根據(jù)2000年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級(jí)10例，Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ級(jí)15例，Ⅳ級(jí)19例。另外選取同時(shí)在該院接受因顱腦損傷行內(nèi)減壓術(shù)患者的正常腦組織37例為對(duì)照，全部標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，普通石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.2 試劑 鼠抗人Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1單克隆抗體購自BD Pharmingen公司，兔抗人PHH3多克隆抗體購自Upstate Group LLC公司，S-P試劑盒和SAP-9100試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)開發(fā)公司，DAB試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 方法 免疫組化染色采用S-P法。石蠟切片脫蠟水化后，微波抗原修復(fù)，過氧化酶阻斷劑滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，羊血清工作液封閉，滴加一抗4℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗，滴加鏈親和素—過氧化物酶溶液。PHH3標(biāo)記用堅(jiān)固紅顯色，其余標(biāo)記均用DAB顯色，蘇木精復(fù)染。用已知陽性組織切片為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。1.4 結(jié)果判斷 Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1蛋白染色均以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，PHH3染色以細(xì)胞核出現(xiàn)紅色顆粒為陽性細(xì)胞。計(jì)算Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1及PHH3的標(biāo)記指數(shù)（LI）：選取10個(gè)陽性細(xì)胞最密集、背景最清晰區(qū)域，每個(gè)區(qū)域高倍視野（×400）下計(jì)算100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分比，取其平均值即為LI。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

37例正常腦組織均無Cyclin D1、Cyclin A、Cy?clin B1和PHH3的表達(dá)。在59例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，Cyclin D1陽性表達(dá)41例（69.5%），陽性染色信號(hào)出現(xiàn)于胞核，見圖1。Cyclin A陽性表達(dá)41例（69.5%），陽性染色信號(hào)出現(xiàn)于胞核，見圖2。Cy?clin B1陽性表達(dá)37例（62.7%），陽性染色信號(hào)出現(xiàn)于胞核，見圖3。PHH3陽性表達(dá)50例（84.7%），陽性染色信號(hào)出現(xiàn)于胞核，見圖4。4級(jí)腦膠質(zhì)瘤的Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和PHH3的陽性LI比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

Figure 1 The positive expression of protein Cyclin D1 in gradeⅣ glioma(SP×400)圖1 Cyclin D1蛋白在Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞核中的陽性表達(dá)（SP×400）

Figure 2 The positive expression of protein Cyclin A in gradeⅢ glioma(SP×400)圖2 Cyclin A蛋白在Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞核中的陽性表達(dá)（SP×400）

Figure 3 The positive expression of protein Cyclin B1 in gradeⅣ glioma(SP×400)圖3 Cyclin B1蛋白在Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞核中的陽性表達(dá)（SP×400）

Figure 4 The positive expression of protein PHH3 in gradeⅣ glioma(SP×400)圖4 PHH3蛋白在Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞核中的陽性表達(dá)（SP×400）

Table 1 Comparison of Cyclin D1，Cyclin A，Cyclin B1 and PHH3 expressions between different grades of gliomas表1 各級(jí)膠質(zhì)瘤中Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和PHH3的LI比較 （±s）

Table 1 Comparison of Cyclin D1，Cyclin A，Cyclin B1 and PHH3 expressions between different grades of gliomas表1 各級(jí)膠質(zhì)瘤中Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和PHH3的LI比較 （±s）

**P<0.01

分級(jí)Ⅰ級(jí)（1）Ⅱ級(jí)（2）Ⅲ級(jí)（3）Ⅳ級(jí)（4）F n 10 15 15 19 Cyclin D1 0.68±0.92 5.00±4.93 11.50±7.66 17.24±10.41 13.356**Cyclin A 0.50±0.67 3.51±3.29 6.90±5.59 11.31±7.98 9.849**Cyclin B1 0.46±0.60 2.86±3.89 6.61±4.97 13.19±9.17 12.479**PHH3 0.30±0.33 0.69±0.79 5.63±3.34 16.54±8.36 36.121**

3 討論

腫瘤的發(fā)生及發(fā)展是復(fù)雜而漫長的過程，有多種可能的機(jī)制，如癌基因的過度擴(kuò)增，抑癌基因的缺失，生長因子信號(hào)傳導(dǎo)通路的持續(xù)激活等。目前認(rèn)為，這些機(jī)制可直接或間接影響細(xì)胞周期調(diào)控因子的功能，促進(jìn)細(xì)胞周期持續(xù)演進(jìn)，細(xì)胞進(jìn)入自主無限制的增殖和分裂，表現(xiàn)出旺盛的增殖活性而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。從一定程度上講，細(xì)胞周期是所有這些機(jī)制的“最后公路”。

Cyclin D1是G1期細(xì)胞周期素，與細(xì)胞同期依賴激酶（CDK4）或CDK6在G1期結(jié)合形成復(fù)合物，通過激活CDK4或CDK6，使后者催化一系列關(guān)鍵底物（如Rb蛋白）磷酸化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子釋放，促進(jìn)DNA合成而發(fā)揮加速細(xì)胞增殖的正性調(diào)節(jié)作用。正常情況下，Cyclin D1蛋白只是在G1期呈一過性表達(dá)，任何原因引起Cyclin D1持續(xù)高表達(dá)都將使細(xì)胞增殖失控，最終形成腫瘤。許多人類腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)染色體11q13區(qū)域的Cyclin D1基因擴(kuò)增和Cyclin D1蛋白的過度表達(dá)，在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用[5]。本研究結(jié)果顯示Cyclin D1在正常腦組織中不表達(dá)，在各病理等級(jí)的腦膠質(zhì)瘤組織中均存在Cyclin D1的表達(dá)，且其表達(dá)水平隨著腫瘤惡性程度增高而呈升高趨勢，說明膠質(zhì)瘤組織中Cyclin D1的表達(dá)是存在的，并且在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。

Cyclin A基因定位在染色體4q27上，它必須與CDK結(jié)合才能顯示酶的活性。Cyclin A是細(xì)胞周期進(jìn)入S期所必須的調(diào)節(jié)蛋白[6]，它的過表達(dá)將導(dǎo)致處于S期的細(xì)胞明顯增多，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Cyclin A不僅在S期與DNA復(fù)制有關(guān)，而且在有絲分裂的起始階段也起著重要作用[7]。本研究結(jié)果顯示Cyclin A在正常腦組織中不表達(dá)，在各病理等級(jí)的腦膠質(zhì)瘤組織中均存在Cyclin A的表達(dá)，并且其表達(dá)水平隨著腫瘤惡性程度增高而呈升高趨勢，提示隨著腫瘤級(jí)別的增加，有越來越多的細(xì)胞增殖活躍。

在G2期主要是Cyclin B1的表達(dá)增加，有絲分裂結(jié)束時(shí)降低[8]。Cyclin B1蛋白的濃度變化控制著細(xì)胞由G2期向M期的過渡,Cyclin B1在G2/M檢測點(diǎn)的異常增高，是細(xì)胞惡性增殖的主要表現(xiàn)。Cy?clin B1在癌細(xì)胞中過表達(dá)，可能與激酶CDK1形成復(fù)合物，啟動(dòng)有絲分裂，越過細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，導(dǎo)致失控性的細(xì)胞增殖有關(guān)。本研究結(jié)果顯示Cyclin B1在正常腦組織中不表達(dá)，在各病理等級(jí)的腦膠質(zhì)瘤組織中均存在Cyclin B1的表達(dá)，并且其表達(dá)水平隨著腫瘤惡性程度增高而呈升高趨勢，提示Cyclin B1的過表達(dá)可增加進(jìn)入G2/M期的細(xì)胞百分比，從而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

真核細(xì)胞染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位為核小體，組蛋白H3是核小體的組成成分之一。在分裂間期，組蛋白H3的絲氨酸殘基的磷酸化是微不足道的，而在分裂期，磷酸化則達(dá)到了最高峰。PHH3是一種抗磷酸化的組蛋白H3的抗體，組蛋白H3的磷酸化與有絲分裂染色體的濃縮相關(guān)，并且在細(xì)胞的凋亡過程中沒有組蛋白H3的磷酸化。本研究結(jié)果顯示PHH3在正常腦組織中不表達(dá)，在各病理等級(jí)的腦膠質(zhì)瘤組織中均存在PHH3的表達(dá)，并且其表達(dá)水平隨著腫瘤惡性程度增高而呈升高趨勢。因此，PHH3可以作為核分裂的特殊標(biāo)記以快速、有效、客觀地進(jìn)行細(xì)胞增殖的定量分析[9]。

綜上，Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和PHH3在細(xì)胞周期調(diào)控過程中起關(guān)鍵作用，檢測腦膠質(zhì)瘤組織中的Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和PHH3蛋白的表達(dá)水平，可輔助常規(guī)病理診斷并為判斷預(yù)后提供信息。

[1]Sherr CJ.Cancer cell cycles[J].Science,1996,274(5293):1672-1677.

[2]張雷.Cyclin B1與腫瘤發(fā)生發(fā)展[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（18）：1676-1678．

[3]孫永剛,彭貴勇,肖天利,等.食管癌組織中S期激酶相關(guān)蛋白2 mRNA的表達(dá)意義[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27（6）：565-567.

[4]黃曼玲，楊玉珍.細(xì)胞周期蛋白與消化道腫瘤[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2004，15（5）：558-560．

[5]Nadal A,Cardesa A.Molecular biology of laryngeal squamous cell carcinoma[J].Virchows Arch,2003,442(1):1-7.

[6]葉菲，金銀姬，金曉明，等.周期蛋白A,E在胃低分化腺癌中表達(dá)的研究[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，40（1）：1-3．

[7]Pagano M,Pepperkok R,Verde F,et al.Cyclin a is required at two points in the human cell cycle[J].EMBO J,1992,11(3):961-971.

[8]Dynlacht BD.Regulation of transcription by proteins that control the cell cycle[J].Nature,1997,389:149-152.

[9]Orchel J,Slowinski J,Mazurek U,et al.H3 mRNA level as a new pro?liferative marker in astrocytomas[J].Biochim Biophys Acta,2004,1689(1):42-46.