丁亞駿，何璐云，王亞楠，張亞娟，康巧珍

(鄭州大學(xué)生物工程系 河南鄭州 450001)

中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤(rùn)往往會(huì)伴隨著幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)在人的胃黏膜定植而產(chǎn)生，中性白細(xì)胞浸潤(rùn)與胃黏膜損傷程度有一定的相關(guān)性。在H.pylori的水抽提物中含有一種能趨化并激活白細(xì)胞的成分，稱(chēng)為中性白細(xì)胞激活蛋白(neutrophil-activating protein，NAP)［1-4］。幾乎在所有 H.pylori菌株中都含有編碼HP-NAP的基因HP-napA，Satin等［5］提出NAP是H.pylori的主要毒力因子并且可以作為疫苗研究中的免疫保護(hù)性候選抗原。目前HP-NAP在H.pylori免疫反應(yīng)中的作用正在逐步的研究與探索之中。但從H.pylori菌株中直接大規(guī)模純化這一組分存在一定難度。隨著研究深入傳統(tǒng)的純化方法無(wú)法滿足科研需求。如今科研工作者從與大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein，MBP)融合表達(dá) HP-NAP工程菌 E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)中快速高效分離純化重組融合蛋白。然而以往對(duì)rMBP-NAP的分離純化大多采用FPLC分子排阻層析法，該方法廉價(jià)，但伴隨的是提取蛋白濃度、純度有限，且耗時(shí)較長(zhǎng)、消耗精力較大，無(wú)法滿足后期實(shí)驗(yàn)對(duì)該蛋白的質(zhì)與量上的需求。本實(shí)驗(yàn)采用直鏈淀粉樹(shù)脂親和層析法對(duì)rMBP-NAP進(jìn)行分離純化，快速分離純化出高濃度、高純度的融合蛋白rMBP-NAP，為HP-NAP的疫苗研究等后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供材料。

1 材料與方法

1.1 工程菌及主要試劑 基因工程菌 E.coli TB1(pMAL-c2X-napA);直鏈淀粉樹(shù)脂層析柱。

1.2 rMBP-NAP的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取工程菌單菌落接種于氨芐青霉素培養(yǎng)液中，37℃ 200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，取菌液接種于豐富培養(yǎng)基中(含氨芐)，37℃ 230 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終度濃度0.3 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng) 3 h。取菌液 200 μL 離心，10%分離膠(SDS-PAGE)檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)效果。

1.3 菌體的收獲及超聲破碎 IPTG誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物分裝于離心管，4℃ 4 000 g離心20 min，棄上清，用5 ml過(guò)柱緩沖重懸沉淀，－20℃凍存過(guò)夜，室溫解凍，于冰水浴中300 W 短脈沖超聲破碎(超聲5 s，間隔15 s，重復(fù)20次左右)至菌液透明。4℃ 9 000 g離心30 min，轉(zhuǎn)移上清，分別取超聲上清和沉淀行 SDSPAGE，分析融合蛋白rMBP-NAP的可溶性。

1.4 SDS-PAGE 凝膠圖像分析儀照相。

1.5 親和層析分離純化rMBP-NAP

1.5.1 親和層析柱的制備:將直鏈淀粉樹(shù)脂灌入層析柱。以8倍柱子體積的過(guò)柱緩沖液(20 mmol Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA)平衡柱子。

1.5.2 超聲上清過(guò)柱:超聲破碎并離心后所得的上清，用過(guò)柱緩沖液稀釋(1∶5)，以1 mL/min的速度使液體通過(guò)親和層析柱。

1.5.3 雜蛋白的去除:用12倍柱體積的過(guò)柱緩沖液沖洗親和層析柱。

1.5.4 洗脫rMBP-NAP:用含有濃度為10 mmol/L麥芽糖的過(guò)柱緩沖液洗滌柱子，用5 mL滅菌離心管收集洗脫液，每管3 mL，共收集20管。SDS-PAGE檢測(cè)每管洗脫液中的蛋白成分。

1.6 rMBP-NAP濃度測(cè)定 蛋白質(zhì)定量試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)檢測(cè)蛋白濃度。

1.7 rMBP-NAP純度檢測(cè) 使用 ImageJ(version 1.44p)檢測(cè)融合蛋白純度。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE檢測(cè)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)效果 rMBPNAP相對(duì)分子質(zhì)量約57 kD與預(yù)期結(jié)果一致。IPTG成功誘導(dǎo)工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-nap)表達(dá)融合蛋白rMBP-NAP，見(jiàn)圖1。

圖1 IPTG誘導(dǎo)基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)表達(dá)rMBP-NAP

2.2 SDS-PAGE檢測(cè) rMBP-NAP融合蛋白可溶性 E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)誘導(dǎo)表達(dá)的rMBPNAP主要以可溶性形式存在于超聲上清中，相對(duì)分子質(zhì)量約為57 000，與預(yù)期結(jié)果一致，見(jiàn)圖2。

圖2 IPTG誘導(dǎo)基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)表達(dá)融合蛋白rMBP-NAP的可溶性檢測(cè)

2.3 SDS-PAGE檢測(cè)rMBP-NAP親和層析效果IPTG誘導(dǎo)的基因工程菌 E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)超聲上清，用直鏈淀粉樹(shù)脂親和層析柱純化，洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，見(jiàn)圖3。

圖3 SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白rMBP-NAP直鏈淀粉樹(shù)脂親和層析效果

2.4 rMBP-NAP蛋白濃度測(cè)定 參照蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)，酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。融合蛋白rMBP-NAP吸光度OD570=0.64，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出蛋白濃度為625 μg/mL，見(jiàn)圖4。

圖4 蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)rMBP-NAP蛋白濃度

2.5 融合蛋白rMBP-NAP純度檢測(cè) 親和層析純化后的rMBP-NAP融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后，利用軟件ImageJ(version1.44p)根據(jù)SDS-PAGE照片繪圖計(jì)算蛋白純度。軟件計(jì)算得出rMBP-NAP純度為96.78% 。

3 討論

以往的實(shí)驗(yàn)研究中，獲取rMBP-NAP采用的是快速蛋白液相層析色譜法(FPLC)，是運(yùn)用快速蛋白純化全自動(dòng)色譜系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行分離純化。該方法效率較為優(yōu)越，靈敏度高(可達(dá)到10－9g/ml數(shù)量級(jí))，洗脫過(guò)程梯度變化，洗脫效果好。但是，F(xiàn)PLC方法在實(shí)行的過(guò)程中，需要有專(zhuān)業(yè)的人士來(lái)操縱快速蛋白液相分析系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)人員要求較高。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用直鏈淀粉樹(shù)脂，對(duì)IPTG誘導(dǎo)工程菌表達(dá)的重組蛋白rMBP-NAP直接進(jìn)行親和層析，實(shí)現(xiàn)了一步純化。該方法操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)周期短，純化得到的rMBP-NAP具有較高濃度和純度，可滿足科研的需要。同時(shí)，與HP-NAP融合表達(dá)的麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)不僅可用于親合層析，還有商品化的MBP抗血清，可用于免疫反應(yīng)跟蹤鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這對(duì)一種新的重組蛋白的鑒定尤為重要。

有報(bào)道，應(yīng)用FPLC分子排阻層析法分離的rMBPNAP 的純度為 91% ，含量為 0.121 g/ml［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，直鏈淀粉樹(shù)脂親和層析法分離純化rMBPNAP無(wú)論是從效率上還是純度上都優(yōu)于FPLC分子排阻層析法。因此，應(yīng)用直鏈淀粉樹(shù)脂親和層析法可更快更好地分離純化融合蛋白rMBP-NAP，為HP-NAP的疫苗研究等后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供材料。

［1］周永寧，徐采樸.幽門(mén)螺桿菌中性白細(xì)胞激活蛋白的研究進(jìn)展［J］.免疫學(xué)雜志，2001，17(3):53-55.

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［4］Gaia Codolo，Paola Mazzi，Amedeo Amedei，et al.The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down－modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma［J］.Cellular Microbiology，2008，10(11)，2355-2363.

［5］Satin B，Del Giudice DG Della，Bianca DV，et al.The neutrophilactivating protein(HP-NAP)of Helicobacter pylori is a protective antigen and a major virulence factor［J］.J Exp Med，2000，191(9):1467-1476.