李靈招，崔 晶，王中全

(1.鄭州市中心醫(yī)院檢驗科 河南鄭州 450007;2.鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院寄生蟲學教研室 河南鄭州450052)

旋毛蟲病(trichinellosis)是一種嚴重的人獸共患寄生蟲病，人體感染旋毛蟲主要因生食或半生食含有幼蟲囊包的豬肉及其肉制品所致。我國西藏地區(qū)自1964年報道首例旋毛蟲病人以來［1］，至2009年在該地區(qū)已發(fā)生15次人體旋毛蟲病暴發(fā)，發(fā)病187例，死亡12人［2，3］。目前，國際上已將旋毛蟲屬分為8個種:即旋毛蟲(T.spiralis，T1)、鄉(xiāng)土旋毛蟲(T.nativa，T2)、布氏旋毛蟲(T.britovi，T3)、偽旋毛蟲(T.pseudospiralis，T4)、米氏旋毛蟲(T.murrelli，T5)、納氏旋毛蟲(T.nelsoni，T7)、巴布亞旋毛蟲(T.papuae，T10)及津巴布韋旋毛蟲(T.zimbabwensis，T11)，以及4個分類地位尚未確定的基因型，即Trichinella T6、T8、T9及T12［4］。我國現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)存在有2個種，即旋毛蟲和鄉(xiāng)土旋毛蟲［5］。2009年在臺灣省還發(fā)生了因食海龜引起的旋毛蟲病暴發(fā)，其病因可能為T10或T11。我國地域遼闊，動物種類和數(shù)量眾多，是否還存在有其他種旋毛蟲，目前尚不清楚。本文對我國西藏地區(qū)豬源旋毛蟲地理株的形態(tài)、生殖力指數(shù)(Reproductive capacity index，RCI)及冷凍耐力(freezing tolerance)等生物學特性進行了研究，并與河南地理株進行了比較。

1 材料與方法

1.1 旋毛蟲與實驗動物 旋毛蟲西藏株與河南株分別來自林芝與南陽豬源旋毛蟲，由本教研室昆明小鼠傳代保種。4周齡健康雄性昆明小鼠，18～20 g，購自鄭州大學實驗動物中心。

1.2 肌幼蟲收集 將旋毛蟲不同地理株感染小鼠后42 d拉頸處死，剝皮后剔除內(nèi)臟和脂肪，先取一小塊膈肌壓片鏡檢，觀察有無旋毛蟲感染。然后將小鼠胴體稱重，用人工消化液［0.1%胃蛋白酶(活性為1∶30 000)－0.7% 鹽酸 －0.85%氯化鈉］消化，肌肉與消化液之比為1 g∶10 ml。消化后按貝氏法收集純凈的旋毛蟲肌幼蟲，生理鹽水反復(fù)洗滌后鏡下計數(shù)［6］。

1.3 形態(tài)學觀察

1.3.1 囊包大小:剖殺感染旋毛蟲42 d的小鼠，將含有幼蟲囊包的肉樣壓片后在光鏡下(×100)觀察，應(yīng)用Image－Pro Express C軟件測定90個囊包的長度與寬度，分別計算囊包長度和寬度的平均值及標準差。

1.3.2 肌幼蟲長度:將分離的肌幼蟲懸液滴于試管中，將其底部放入燒杯中水浴，邊加熱邊輕微振蕩試管，當燒杯內(nèi)水溫達到90℃時停止加熱。取加熱后的肌幼蟲懸液滴于潔凈的載玻片上，加蓋片后在裝有顯微測微尺的光學顯微鏡下用低倍鏡(×100)觀察，用數(shù)碼相機獲取其圖像，保存為計算機文件后進行測量和分析［7］。測量60條肌幼蟲的長度，計算其均值。對于彎曲的蟲體，用目鏡測微尺分段測量，各段數(shù)值相加后即為肌幼蟲長度。

1.3.3 生殖力指數(shù)(RCI):將20只昆明小鼠隨機分為2組，每組10只，分別感染旋毛蟲西藏株與河南株，每只小鼠經(jīng)口感染300條肌幼蟲。42 d后剖殺，消化全身肌肉后收集肌幼蟲，計數(shù)RCI，RCI=實驗動物感染旋毛蟲后42 d回收的肌幼蟲數(shù)/接種的肌幼蟲數(shù)［8］。

1.3.4 冷凍耐力試驗 :將分別感染旋毛蟲河南株和西藏的小鼠肌肉(各100 g)剪碎成小米粒大小，分別平均分成5份，每份重20 g，置于塑料袋內(nèi)－18℃冰箱中分別凍存 12、24、36、48、72 h，將冷凍肉樣于室溫下自然解凍3 h，然后將肌肉人工消化后計數(shù)活幼蟲數(shù)。幼蟲卷曲或在溫水中活動為活幼蟲，幼蟲呈逗號和C字型并且在溫水中不活動的為死幼蟲。將50只小鼠隨機分為10組(每組5只)，每只分別經(jīng)口感染－18℃保存12、24、36、48和72 h的旋毛蟲河南株或西藏株300條幼蟲，感染后42 d后剖殺，分別將小鼠肌肉人工消化后計數(shù)回收的幼蟲數(shù)及RCI。另各取5份感染旋毛蟲河南株和西藏的小鼠肌肉(每份重20 g)，置于塑料袋內(nèi) －26 ℃分別凍存 12、24、36、48 h，如上所述方法觀察活幼蟲比例，分別接種4組小鼠(每組5只)后觀察其感染性。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，采用本非參數(shù)檢驗和t檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 旋毛蟲西藏株囊包形態(tài)與大小 旋毛蟲西藏株囊包呈長橢圓形，每個囊包內(nèi)含1條幼蟲(圖1)。囊包長度與寬度見表1。經(jīng)統(tǒng)計學分析，西藏株囊包長度和寬度與河南株囊包的差異均無統(tǒng)計學意義(t=1.312，t= －0.046，P 均＞ 0.05)。

圖1 旋毛蟲西藏株幼蟲囊包形態(tài)(×100)

表1 旋毛蟲河南株與西藏株幼蟲囊包大小(n=90)

2.2 肌幼蟲長度 旋毛蟲西藏株和河南株的肌幼蟲長度分別為(1 122.02 ±99.86)μm 和(1 105.66 ±46.96)μm，2個旋毛蟲地理株肌幼蟲長度的差異無統(tǒng)計學意義(t= －1.148，P ＞0.05)。

2.3 生殖力指數(shù) 旋毛蟲西藏株與河南株在小鼠體內(nèi)的生殖力指數(shù)分別為213.83±76.16和268.87±33.58，差異無統(tǒng)計學意義(Z= －1.681，P=0.093 ＞0.05)。

2.4 冷凍耐力試驗 旋毛蟲西藏株－18℃冷凍48 h之后仍然有卷曲的活幼蟲，幼蟲存活率為16.7%，冷凍72 h幼蟲全部死亡。而旋毛蟲河南株于－18℃冷凍48 h幼蟲已全部死亡(表2)。從冷凍肉樣中收集的幼蟲接種小鼠后42 d回收的幼蟲數(shù)與RCI見表3。旋毛蟲西藏株經(jīng)－18℃凍存12、24及36 h后的RCI均明顯高于河南株(Z12= － 2.611，Z24= － 2.627，Z36= －2.795，P 均 ＜0.01)。西藏株 －18 ℃凍存48 h才完全失去感染性，而河南株－18℃凍存36 h即已失去感染性。

表2 旋毛蟲西藏株與河南株－18℃冷凍不同時間后肌幼蟲存活情況〔n(%)〕

當含有旋毛蟲西藏株肌幼蟲的肌肉經(jīng)－26℃凍存12、24、36及48 h后的活幼蟲比例分別為72.8%(650/893)、8.3%(53/635)、0.9%(11/1204)及 0%(0/1307)，接種小鼠后的 RCI分別為 0.50 ±0.015、0.20±0.008、0及0;而含有河南株肌幼蟲的肌肉經(jīng)－26℃凍存12、24 h后的活幼蟲比例僅分別為5.4%(29/536)及0%(0/718)，接種小鼠后的RCI分別為0.3±0.015及0。旋毛蟲西藏株經(jīng)－26℃凍存12、24 h后的RCI均明顯高于河南株(Z12=－2.652，Z24=－2.805，P 均 ＜0.01)。

表3 旋毛蟲西藏株與河南株－18℃冷凍不同時間接種小鼠后的RCI

3 討論

本研究中所用的旋毛蟲西藏株與河南株經(jīng)PCR等方法鑒定均屬于 T.spiralis(T1)［9］，這2個旋毛蟲地理株的囊包與肌幼蟲大小與生殖力指數(shù)均無明顯差異，表明肌幼蟲形態(tài)與生殖力指數(shù)僅能作為旋毛蟲屬分類的參考，而不能作為區(qū)分旋毛蟲種和地理株的生物學特征［10］。

冷凍耐力是旋毛蟲的生物學特性之一，是旋毛蟲對寒冷環(huán)境長期適應(yīng)和耐受的一個自身調(diào)整的過程，也是宿主和旋毛蟲之間相互作用的結(jié)果，已成為旋毛蟲屬分類與鑒定中的一個常用指標［11］。旋毛蟲肌幼蟲對低溫的耐受力直接受宿主類型、地理環(huán)境與溫度、蟲齡等多種因素的影響［12，13］。本研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲西藏株對低溫的耐受力明顯高于河南株，可能與西藏株長期處于低溫環(huán)境、已經(jīng)形成了對低溫的適應(yīng)性有關(guān)。西藏林芝地區(qū)與河南南陽地區(qū)的平均氣溫分別為8.7℃和14.4～15.7℃，且林芝地區(qū)一年內(nèi)低溫的時間段明顯多于南陽地區(qū)。目前，在一些國家出售豬肉及其肉制品之前經(jīng)過冷凍處理已經(jīng)成為一種降低旋毛蟲感染風險的安全措施之一，但對新鮮肉類在一定的溫度下冷凍足夠的時間才能完全殺死旋毛蟲［14，15］。如豬肉應(yīng)切成小于15 cm厚的肉塊，在 －15℃冷凍20 d、－23℃冷凍10 d，－29℃ 冷凍6 d，其中的旋毛蟲才能完全喪失感染性，且冷凍處理僅對豬肉中的T.spiralis有效，而對抗低溫的T.nativa則無效。本文結(jié)果表明旋毛蟲西藏株經(jīng)－18℃凍存36 h、－26℃凍存24 h后部分蟲體仍有感染性。

冷凍處理肉類雖有可能降低旋毛蟲肌幼蟲的感染性和生殖力，其效果受旋毛蟲蟲種、肉塊大小、溫度、冷凍時間等多種因素的影響，在實際應(yīng)用中冷凍處理肉類對旋毛蟲幼蟲的殺傷效果較難進行評價。因此，在流行區(qū)進行健康教育仍是預(yù)防旋毛蟲病的關(guān)鍵措施。改變不良的飲食習慣和烹飪方法，不生食或半生食豬肉及其它動物肉類和肉制品。尤其是在西藏等高原地區(qū)，肉類及肉制品應(yīng)完全做熟，以確保肉類食品安全［16］。試驗表明，只有當肉塊中心溫度達到71℃時囊包內(nèi)的旋毛蟲幼蟲才可被殺死。

［1］Wang Z Q，Cui J.Epidemiology of human trichinellosis in China during 1964 － 1999［J］.Parasite，2001，8(Sppl):S63-S66.

［2］Wang Z Q，Cui J，Xu B L.The epidemiology of human trichinellosis in China during 2000 －2003［J］.Acta Trop，2006，97(3):247-251.

［3］Cui J，Wang Z Q，Xu B L.The epidemiology of human trichinellosis in China during 2004 －2009［J］.Acta Trop，2011，118(1):1-5.

［4］王中全，崔晶.旋毛蟲屬分類的研究進展［J］.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2002，20(5):310.

［5］Wang Z Q，Cui J，Shen L J.The epidemiology of animal trichinellosis in China［J］.Vet J，2007，173(2):391-398.

［6］Li F，Cui J，Wang Z Q，et al.Factors affecting the sensitivity of artificial digestion and its optimization for inspection of Trichinella spiralis in meat［J］.Foodborne Pathog Dis，2010，7(8):879-885.

［7］郭鄂平，曾凡龍，王珺.旋毛蟲幼蟲形態(tài)顯微測量方法分析［J］.畜牧與獸醫(yī)，2005，37(4):32-34.

［8］Belosevic M，Dick T A.Trichinella spiralis:comparison of stages in host intestine with those of an Arctic Trichinella sp［J］.Exp Parasitol，1979，48(3):432-446.

［9］Wang Z Q，Li L Z，Jiang P，et al.Molecular identification and phylogenetic analysis of Trichinella isolates from different provinces in mainland China［J］.Parasitol Res，2011，110(2):753-757.

［10］Pozio E，Darwin Murrell K.Systematics and epidemiology of Trichinella［J］.Adv Parasitol，2006，63:367-439.

［11］Smith H J.Differentiation of Trichinella spiralis and Trichinella nativa based on resistance to low temperature refrigeration［J］.Can J Comp Med，1983，17(4):501-502.

［12］Malakauskas A，Kapel C M.Tolerance to low temperatures of domestic and sylvatic Trichinella spp.in rat muscle tissue［J］.J Parasitol，2003，89(4):744-748.

［13］Hill D E，F(xiàn)orbes L，Gajadhar A A，et al.Viability and infectivity of Trichinella spiralis muscle larvae in frozen horse tissue［J］.Vet Parasitol，2007，146(1 －2):102-106.

［14］Medina-Lerena M S，Ramirez-Alvarez A，Kühne M，et al.Influence of different processing procedures on the reproductive capacity of Trichinella spiralis in pork meat［J］.Trop Anim Health Prod，2009，41(4):437-442.

［15］Gamble H R，Bessonov A S，Cuperlovic K，et al.International Commission on Trichinellosis:recommendations on methods for the control of Trichinella in domestic and wild animals intended for human consumption［J］.Vet Parasitol，2000，93(3-4):393-408.

［16］Gajadhar A A，Pozio E，Gamble H R，et al.Trichinella diagnostics and control:mandatory and best practices for ensuring food safety［J］.Vet Parasitol，2009，159(3-4):197-205.