陳文珍，王開(kāi)顏，洪 震，劉學(xué)源，陳玉娟

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200072;2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200040)

研究近年表明，戊四氮(pentylenetetrazol，PTZ)誘發(fā)急性癲發(fā)作和慢性癲模型形成過(guò)程5－羥色胺(5－HT)動(dòng)態(tài)變化中，在急性發(fā)作海馬5－HT顯著升高，在慢性癲模型形成過(guò)程，海馬5－HT水平隨著點(diǎn)燃的時(shí)間延長(zhǎng)而逐步降低［1－2］。那么腦內(nèi)5－HT水平升高或降低對(duì)癲的形成會(huì)有什么樣的影響呢?本文分別用西酞普蘭(升高5－HT)和利血平(降低5－HT)干預(yù)，研究大腦5－HT變化對(duì)PTZ點(diǎn)燃慢性癲形成過(guò)程的影響，為癲形成的干預(yù)措施提供有效的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PTZ、5－HT(Sigma USA);水合氯醛(上?；瘜W(xué)試劑公司);多導(dǎo)生理記錄儀(BioPAC systems MP150，USA)。

腦內(nèi)微透析系統(tǒng):包括CMA/120清醒動(dòng)物裝置、CMA/102微量泵、CMA/170低溫樣品收集器、CMA/150動(dòng)物溫度控制器、CMA/12微透析探頭(膜長(zhǎng)2 mm、內(nèi)徑400 mm、外徑500 mm、允許透過(guò)的最大分子質(zhì)量界限值為20 000道爾頓)，套管，微電腦工作站，2 μm無(wú)菌針頭濾膜。

高效液相色譜儀組成:ESA Model 582 pump，BAS Sample Sentinel autosampler，and ESA CouloChem Ⅲ detector，Enhanced Model 5041 Cell，Model 5020 Guard Cell，EZChrom Elite data system.BAS USA。

1.2 實(shí)驗(yàn)大鼠分組和模型大鼠癲發(fā)作程度的評(píng)估

清潔級(jí)健康成年雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量250～300 g(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供)。置室溫(24±2)℃，24 h晝夜循環(huán)光照條件下生活，保證環(huán)境安靜和晝夜節(jié)律。大鼠隨機(jī)分為4組:(1)對(duì)照組，每日同一時(shí)間點(diǎn)，腹腔注射生理鹽水;(2)戊四氮組(PTZ group，PTZ組)、每日同樣時(shí)間腹腔注射1%PTZ(Sigma公司，美國(guó))35 mg/kg，且在用PTZ注射前0.5 h予以生理鹽水1 ml/d灌胃7 d作為對(duì)照，分別在 PTZ注射第7、14、21、28 d的發(fā)作間期(PTZ注射誘發(fā)癲發(fā)作后3 h)行微透析取樣。(3)西酞普蘭組(CTP+PTZ group，CTP組):為了評(píng)估5－HT水平升高對(duì)癲形成的影響作用，用西酞普蘭(一種選擇性5－HT再攝取抑制劑)提高大鼠腦內(nèi)5－HT濃度，在用PTZ每日(35 mg/kg)腹腔注射一周前開(kāi)始給予西酞普蘭(Citalopram，西安楊森公司提供)灌胃，0.5 mg/kg(按成人劑量20 mg/d，折算而得)干預(yù)。每日在PTZ腹腔注射前0.5 h予西酞普蘭灌胃，在PTZ腹腔注射第7、14、21、28 d的發(fā)作間期(PTZ注射誘發(fā)癲發(fā)作后3 h)進(jìn)行微透析取樣。(4)利血平組(RSP+PTZ group，RSP 組):為了評(píng)估 5－HT 水平降對(duì)癲形成產(chǎn)生的作用，用利血平(5－HT耗竭劑)降低5－HT水平，每日在PTZ(35 mg/kg)腹腔注射一周前開(kāi)始給予灌胃利血平(Reserpine，復(fù)旦復(fù)華制藥)，1 mg/kg(按成人劑量40 mg/d，折算而得)干預(yù)，每日在PTZ注射前0.5 h予利血平灌胃，在PTZ腹腔注射點(diǎn)燃第7、14、21、28 d發(fā)作間期(PTZ注射誘發(fā)癲發(fā)作后3 h)進(jìn)行微透析取樣。

1.3 微透析活體獲取大鼠腦海馬組織間液［4］

1.3.1 微透析探針外套管和海馬電極導(dǎo)管安置術(shù)10%的水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠至大鼠翻轉(zhuǎn)反射消失，再以2%利多卡因雙側(cè)外耳道表面麻醉，將大鼠頭顱水平固定于立體定向儀上(背朝上固定呈頭顱水平位)。常規(guī)消毒，正中矢狀位切口，分離骨膜，用3%H2O2止血并充分暴露前囟，確認(rèn)前后囟在同一平面。根據(jù)Paxinos and Watson的《大鼠腦立體定位圖譜》［5］確定右側(cè)海馬CA1和CA3區(qū)靶點(diǎn):CA1區(qū)在前囟向后5.6 mm，矢狀縫線向右側(cè)4.6 mm，硬膜向下4.6 mm，置入微透析外套管;CA3區(qū)前囟向后2.64 mm，矢狀縫線向右側(cè)2.0 mm，硬膜向下 4.0 mm，置入電極導(dǎo)管。

同時(shí)在顱骨上旋入4 mm螺絲，與其他兩點(diǎn)形成三角形，用牙科水泥固定在鉆孔周?chē)娘B骨上，待牙科水泥凝固后形成一個(gè)平面，常規(guī)消毒并縫合傷口，待大鼠清醒后送回動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)中保證微透析實(shí)驗(yàn)和腦內(nèi)海馬電極檢查順利進(jìn)行。

1.3.2 人工腦脊液配置［6］NaCl 126、KCl 5、MgSO42、CaCl22、NaH2PO41.25、NaHCO326、Glu 10 mmol/L，調(diào)節(jié) pH 值為7.4，2 μm 無(wú)菌針頭濾膜過(guò)濾，4℃冰箱保存，2周內(nèi)用于微透析實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 微透析活體取樣 在大鼠清醒狀態(tài)下移去導(dǎo)引管針芯，連接微透析裝置，排出系統(tǒng)中的氣泡，將探針沿導(dǎo)管插入大鼠海馬，探針前端2 mm半透膜完全置于海馬內(nèi)，微量泵內(nèi)充滿(mǎn)人工腦脊液，微灌注泵以2 μl/min的恒定流速使人工腦脊液通過(guò)流入管、探針、流出管。平衡1 h，使探針內(nèi)人工腦脊液和大鼠海馬細(xì)胞外液的物質(zhì)交換趨于穩(wěn)定，然后連接微透析裝置以便檢測(cè)。

1.3.4 取樣時(shí)間 在第7、14、21、28 d發(fā)作間期分別取樣1次，每次收集 30 min透析液樣品，置Eppendorf管中，每管 60 μl，－80 ℃ 冰箱保存，2 周內(nèi)用于高效液相檢測(cè);對(duì)照組取樣1次。

1.3.5 各組體外回收率測(cè)定法 配置333 ng/ml，5－HT標(biāo)準(zhǔn)液，37℃，將探針前端浸在溶液中，以2 μl/min的流速推動(dòng)人工腦脊液通過(guò)探針。平衡1 h后，連續(xù)收集流出液60 μl/次，共3管。

1.3.6 高效液相檢測(cè)儀 分別檢測(cè)回收腦組織間液和標(biāo)準(zhǔn)液中 5－HT、5－HIAA 濃度。

1.3.7 5－HT、5－HIAA 濃度和 5－HT 轉(zhuǎn)化率公式

1.3.8 海馬靶點(diǎn)確認(rèn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用4%多聚甲醛對(duì)動(dòng)物進(jìn)行心臟灌流，取鼠腦，冰凍切片機(jī)切片，行蘇木精－伊紅染色確定探針?biāo)谖恢脼楹ｑR。

1.4 腦電圖(EEG)記錄

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用均數(shù)兩兩比較t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)觀察結(jié)果

生理鹽水對(duì)照組未出現(xiàn)發(fā)作。(1)在點(diǎn)燃期間，CTP組，14 d以?xún)?nèi)，其發(fā)作程度為1～3級(jí)，發(fā)作潛伏期較長(zhǎng)，20 d左右出現(xiàn)5級(jí)發(fā)作，24 d全部點(diǎn)燃，無(wú)動(dòng)物死亡;在點(diǎn)燃期間，CTP組發(fā)作潛伏期延長(zhǎng)，發(fā)作程度輕和點(diǎn)燃時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)作死亡率低，與PTZ組比較差異有顯著性(P＜0.05);點(diǎn)燃后，CTP組誘發(fā)發(fā)作潛伏期、發(fā)作程度等與戊四氮組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)在點(diǎn)燃期間，RSP組，在腹腔注射3～5 d內(nèi)就出現(xiàn)3～5級(jí)發(fā)作，7 d就有3～4只點(diǎn)燃，10 d左右全部點(diǎn)燃，有2只出現(xiàn)癲持續(xù)狀態(tài)后死亡;在點(diǎn)燃期間，RSP組誘發(fā)發(fā)作程度重，發(fā)作潛伏期短、點(diǎn)燃時(shí)間短，發(fā)作持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，死亡率高，與戊四氮組和對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05);點(diǎn)燃維持期，發(fā)作情況與戊四氮組差異無(wú)顯著性，見(jiàn)表1。

表1 戊四氮點(diǎn)燃癲 形成過(guò)程各組主要參數(shù)比較Tab.1 Parameters of PTZ kindling epileptic model by different groups in rats

2.2 大鼠點(diǎn)燃后各組發(fā)作前后典型EEG表現(xiàn)(圖1、2)

對(duì)照組為正常EEG。PTZ點(diǎn)燃第7、14、21天可見(jiàn)散在尖波，第28天可見(jiàn)自發(fā)癲樣放電。PTZ點(diǎn)燃第7、14、21、28 天發(fā)作時(shí)出現(xiàn)癲波潛伏期隨點(diǎn)燃時(shí)間延長(zhǎng)而縮短，均出現(xiàn)尖波、棘波、尖慢及棘慢綜合波等。在點(diǎn)燃期間(第7天和第14天)，各組腦電圖典型表現(xiàn)略有差異，RSP組尖波爆發(fā)的幅度和數(shù)量均比CTP組高;在維持點(diǎn)燃期間(第21天和28天)，CTP組、RSP組和PTZ組的腦電圖比較無(wú)明顯差異。

圖1 戊四氮點(diǎn)燃大鼠發(fā)作間期典型EEG表現(xiàn)Fig.1 Interictal typical EEG of PTZ kindling rats

圖2 戊四氮點(diǎn)燃大鼠發(fā)作期典型EEG表現(xiàn)Fig.2 Ictal typical EEG of PTZ kindling rats

2.3 5－HT 和5－HIAA 濃度以及5－HT 轉(zhuǎn)化率變化

體外回收率為15% ～20%，計(jì)算各組發(fā)作間期的5－HT和5－HIAA濃度以及5－HT轉(zhuǎn)化率結(jié)果如表2所示。(1)在戊四氮點(diǎn)燃癲形成過(guò)程中，發(fā)作間期5－HT水平，點(diǎn)燃初期，CTP組大鼠的海馬 5－HT 水平升高，5－HT 轉(zhuǎn)化率(5－HIAA/5－HT)降低，與對(duì)照組和PTZ組比較有顯著性差異(P＜0.05);維持點(diǎn)燃階段，CTP組，5－HT 水平逐日降低，與戊四氮組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05);CTP組5－HIAA水平在點(diǎn)燃過(guò)程逐步降低與對(duì)照組和點(diǎn)燃不同時(shí)期比較，差異有顯著性(P＜0.01)，與戊四氮組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;點(diǎn)燃維持期5－HT轉(zhuǎn)化率(5－HIAA/5－HT)變化與PTZ組和對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)RSP組，在點(diǎn)燃期間，5－HT水平降低與戊四氮組和對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05);點(diǎn)燃維持期，RSP組5－HT水平逐漸下降與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)和PTZ組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;RSP組5－HIAA水平，呈逐日下降趨勢(shì)，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，與PTZ組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;5－HT轉(zhuǎn)化率(5－HIAA/5－HT)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組和戊四氮組比較差異無(wú)顯著性。

表2 4組各時(shí)間點(diǎn)PTZ點(diǎn)燃大鼠海馬組織間液5-HT、5-HIAA濃度和5-HT轉(zhuǎn)化率Tab.2 Concentration of 5-HT，5-HIAA and 5-HT turnover rate in hippocampus in different time of PTZ kindling rats(x±s)

3 討 論

用西酞普蘭和利血平分別提高和降低腦內(nèi)5－HT水平，通過(guò)改變5－HT水平來(lái)研究PTZ點(diǎn)燃癲形成的變化。結(jié)果顯示，戊四氮點(diǎn)燃癲形成過(guò)程中，在點(diǎn)燃早期，西酞普蘭干預(yù)后使戊四氮誘發(fā)癲發(fā)作潛伏期延長(zhǎng)，發(fā)作程度較輕，發(fā)作持續(xù)時(shí)間短，點(diǎn)燃時(shí)間延長(zhǎng)，死亡率降低;但是，在點(diǎn)燃后，戊四氮誘發(fā)發(fā)作潛伏期，發(fā)作嚴(yán)重程度和發(fā)作持續(xù)時(shí)間與戊四氮組比較無(wú)明顯的區(qū)別。腦電圖顯示在點(diǎn)燃早期西酞普蘭延長(zhǎng)了腦電圖癲波出現(xiàn)的潛伏期，但是在點(diǎn)燃后，并沒(méi)有減少腦電自發(fā)放電和抑制癲波爆發(fā);用HPLC檢測(cè)透析液結(jié)果證明，在點(diǎn)燃早期，CTP組海馬 5－HT 顯著升高，5－HT 轉(zhuǎn)化率降低這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［9］;點(diǎn)燃過(guò)程中，5－HIAA 水平呈持續(xù)性的降低，5－HIAA是5－HT的一種重要代謝產(chǎn)物，5－HIAA濃度在PTZ點(diǎn)燃過(guò)程中逐步減少，但是與5－HT變化并不一致，這跟Burger等研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外5－HT水平升高并沒(méi)有伴隨著5－HIAA變化的結(jié)果相一致［10］。用 5－HIAA/5－HT 比值作為估計(jì)5－HT轉(zhuǎn)化率和代謝的一種近似的工具［11］，在點(diǎn)燃早期(7d)與對(duì)照組比較5－HT轉(zhuǎn)化率降低，提示西酞普蘭作用下，可能導(dǎo)致5－HT分解代謝減少，有學(xué)者在PTZ驚厥模型中發(fā)現(xiàn)，在海馬和前腦皮質(zhì)有比較低的5－HT轉(zhuǎn)化率，與結(jié)果相一致;他們也證明了，PTZ誘導(dǎo)癲發(fā)作減少了西酞普蘭在海馬的結(jié)合，這些數(shù)據(jù)提示，至少在PTZ模型，西酞普蘭減少5－HT 再攝取，可能與 5－HT 轉(zhuǎn)化率降低有關(guān)［7，12］。有文獻(xiàn)報(bào)道，西酞普蘭的作用依靠5－HT濃度和5－HT1A受體作用［12］，在點(diǎn)燃早期 5－HT 神經(jīng)遞質(zhì)和受體活性沒(méi)有受到明顯破壞，給予西酞普蘭干預(yù)，可以升高5－HT水平，降低5－HT轉(zhuǎn)化率，儲(chǔ)存足夠的5－HT，而抑制癲發(fā)作，和延長(zhǎng)點(diǎn)燃時(shí)間。到了點(diǎn)燃后，大鼠海馬神經(jīng)元壞死、丟失，也可能造成部分海馬5－HT神經(jīng)元丟失，分泌5－HT減少，所以，在點(diǎn)燃晚期，沒(méi)有足夠的5－HT濃度，西酞普蘭不能夠抑制癲發(fā)作，也不能阻斷癲形成。

總之，西酞普蘭戊干預(yù)四氮點(diǎn)燃期間可以提高腦內(nèi)5－HT水平，延長(zhǎng)點(diǎn)燃時(shí)間，減輕發(fā)作程度和降低死亡率，點(diǎn)燃形成后，西酞普蘭無(wú)明顯減輕發(fā)作作用;利血平降低5－HT水平，縮短點(diǎn)燃時(shí)間，加重發(fā)作程度，促進(jìn)癲形成。升高5－HT水平對(duì)癲形成有一定的延緩作用。

［1］陳文珍，王開(kāi)顏，劉學(xué)源，等.戊四氮點(diǎn)燃癲大鼠海馬5－羥色胺能神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)研究［J］.中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)，2010，18(5):449 －455.

［2］陳文珍，王開(kāi)顏，洪震，等.戊四氮點(diǎn)燃大鼠癲發(fā)作和癲形成過(guò)程中海馬5－HT水平的變化［J］.癲與神經(jīng)電生理學(xué)雜志，2010，19(4):199－203.

［3］陳自柳，趙玉武，余愛(ài)勇，等.AQP4在癲大鼠海馬區(qū)的表達(dá)及意義［J］.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，29(3):27－29.

［4］Stanley EM，F(xiàn)adel J.Aging－related deficits in orexin/hypocretin modulation of the septohippocampal cholinergic system［J］.Synapse，2012;66(5):445 －452.

［5］Paxinos W.The rat brain in stereotaxic coordinates［M］.Academic Press，2007:6－10.

［6］Miyajima M，Shimoji K，Watanabe M，et al.Role of artificial cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery:a basic investigation［J］.Acta Neurochirurgica，2012，113(suppl):103 －107.

［7］Igelstr?m KM. Preclinicalantiepileptic actions of selective serotonin reuptake inhibitors implications for clinical trial design ［J］. Epilepsia， 2012，53(4):596－605.

［8］Saharia K，Arya U，Kumar R.Reserpine modulates neurotransmitter release to extend lifespan and alleviate age－dependentAβ proteotoxicity in Caenorhabditis elegans［J］.Experimental gerontology，2012，47(8):541－551.

［9］Wallinga AE，Grahlmann C，Granneman RA，et al.Gender differences in hyperthermia and regional 5－HT and 5－HIAA depletion in the brain following MDMA administration in rats［J］.Brain research，2011，1398:13－22.

［10］Geldof M，F(xiàn)reijer JI，Peletier LA，et al.Mechanistic model for the acute effect of fluvoxamine on 5－HT and 5－HIAA concentrations in ratfrontalcortex ［J］.European Journal of Pharmaceutical Sciences，2008，33(3):217－229.

［11］Park H， YooD， KwonS， etal. Acupuncture stimulation at HT7 alleviates depression－induced behavioral changes via regulation ofthe serotonin system in the prefrontal cortex of maternally－separated rat pups［J］.Journal of Physiological Sciences，2012，62(4):351－357.

［12］Raedt R，Clinckers R，Mollet L，et al.Increased hippocampal noradrenaline is a biomarker for efficacy of vagus nerve stimulation in a limbic seizure model［J］.Journal ofneurochemistry，2011，117(3):461－469.