周秀錦，周向陽，鄭 斌，邵宏宏，王淑娜

(1.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江舟山 316000；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 316100)

貝類毒素是有毒有害赤潮生物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)的總稱，又被稱為赤潮生物毒素。貝類毒素不僅嚴(yán)重破壞海洋漁業(yè)資源和水產(chǎn)養(yǎng)殖，惡化海洋環(huán)境，還可以通過食物鏈的傳遞，危害人類健康，造成人體中毒甚至死亡。在世界范圍內(nèi)，由赤潮毒素引起的人員中毒和死亡事件屢見不鮮。

首次報(bào)道記憶缺失性貝類毒素事件是在1987年加拿大愛德華王子島發(fā)生因食用養(yǎng)殖紫貽貝而引起的食物中毒。隨后加拿大國立大西洋研究中心的QUILLIAM等從當(dāng)?shù)鼐用袷秤玫酿B(yǎng)殖貝類體內(nèi)分離出了一種被稱為軟骨藻酸(Domoic Acid，DA)的活性物質(zhì)，確認(rèn)它為引起中毒的化學(xué)物質(zhì)，并肯定該物質(zhì)來源于經(jīng)常在加拿大東海岸形成赤潮的一種硅藻[1]。1996年，墨西哥Baja地區(qū)，成百上千只海鳥因食用體內(nèi)富集高濃度DA的螃蟹、鳳尾魚、沙丁魚中毒死亡[2]。1998年美國加利福尼亞州中部沿海發(fā)生400多頭海獅中毒死亡事件，存活的海獅中有神經(jīng)功能失調(diào)癥狀，從海獅的體液中檢測出了高濃度DA[3]。由DA引起的中毒癥狀包括惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等，同時(shí)有昏眩、昏迷等類似神經(jīng)性中毒癥狀，一段時(shí)間內(nèi)喪失部分記憶是此類中毒的典型特征，因此這類毒素被稱為記憶缺失性貝類毒素[4]。軟骨藻酸是記憶缺失性貝類毒素的最常見生物毒素，是由硅藻門Bacillariophyta、羽紋硅藻綱Pennatae、管殼縫目Aulonoraphidinals、菱形藻科Nitzschiaceae中的擬菱形藻屬Pseudo-nitzschia和菱形藻屬Nitzschia中硅藻的某些種產(chǎn)生的一種興奮性神經(jīng)毒素。軟骨藻酸是一種溶于水具有強(qiáng)烈神經(jīng)毒性、與紅藻酸(2－梭基－3－異丙稀基脯氨酸)相關(guān)的興奮性非蛋白氨基酸類物質(zhì)[5]。軟骨藻酸是長鏈羽狀硅藻Nitzschia pseudodelicatissima的代謝物[6]，熱穩(wěn)定，熔點(diǎn)為223～224℃。易溶于水、稀酸和堿溶液中，微溶于甲醇和乙醇，不溶于石油醚和苯，紫外光譜最大吸收波長為242 nm。水中的貝類和魚類對DA有較強(qiáng)的耐受力，它們可以富集藻類產(chǎn)生的DA，再經(jīng)食物鏈的傳遞對所在地區(qū)的生態(tài)環(huán)境造成影響，人類食用被DA污染的海產(chǎn)品后即可引起中毒。1998年被英國作為貝類動物的常規(guī)檢測項(xiàng)目，規(guī)定DA＜20 mg/kg的貝類才可以食用。

筆者根據(jù)軟骨藻酸貝類毒素的性質(zhì)，建立一種快速簡便的高效液相色譜分析方法。

1 材料與方法

1.1 方法原理

試樣中的記憶缺失性貝類毒素經(jīng)適當(dāng)甲醇水提取，經(jīng)過陰離子柱凈化，用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測；外標(biāo)法定量。

1.2 試劑和材料

實(shí)驗(yàn)所用試劑應(yīng)無干擾峰，除另有特別說明外，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T 6682一級水的要求。

1.2.1 試劑

甲醇、乙腈，色譜純；三氟乙酸，優(yōu)級純；冰乙酸，鹽酸，氫氧化鈉，氨水，甲酸銨，乙酸銨，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，磷酸銨，磷酸氫二銨，庚烷磺酸鈉。標(biāo)準(zhǔn)品：軟骨藻酸(DA)購自加拿大海洋局，Lot＃20071205。

1.2.2 儀器

高效液相色譜儀：配紫外－可見光檢測器(島津LC－20A)；電子天平(梅特樂公司CP124S)：感量0.000 1 g；離心機(jī)(西格瑪公司 3－18K)：10 000 r/min；微孔濾膜：0.45 μm；組織均質(zhì)器(IKA 公司 T25BASIC)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(LABOROTA－4003)；旋渦混合器(IKA 公司 MSI)。

1.3 樣品處理

取樣：用清水清洗外殼，開殼，清水淋洗除去泥沙等外來雜質(zhì)，取可食用部分用作檢測，勻質(zhì)。

提取：稱取試樣5.0 g，于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇水溶液，旋渦混勻，超聲波提取5 min，以4 000 r/min離心5 min，移取全部上清夜至50 mL離心管中。

柱凈化：取陰離子交換柱，依次用6 mL甲醇，3 mL水，3 mL 50%甲醇水溶液過柱活化，然后取提取液5.0 mL，以1滴/s的速度過柱，再用1 mL甲醇洗滌，棄去流出液，擠干，最后用2 mL冰乙酸+甲醇(25+75)洗脫，收集洗脫液。45℃水浴，N2吹干。準(zhǔn)確移取1 mL乙腈+水(1+9)溶解殘留物，轉(zhuǎn)移到5 mL離心管，加入1 mL正己烷萃取，靜置1 min，棄上層液體，下層過0.45 μm微孔濾膜，供高效液相色譜儀檢測。

1.4 色譜條件

色譜柱：Venusil ASB C8，4.6×250 mm；流動相：乙腈+0.1%三氟乙酸+0.02%庚烷磺酸鈉；流速：1.0 mL/min；檢測條件：紫外檢測器，檢測波長242 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：室溫。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以乙腈+水(1+9)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別配成為含軟骨藻酸 0.1、1.0、2.5、10.0、25.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品處理柱凈化步驟進(jìn)行，高效液相色譜儀測定，得出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。測量保留時(shí)間和峰面積，用峰面積和含量作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 計(jì)算

樣品中軟骨藻酸的殘留量按下式計(jì)算。

X/mg·kg-1為樣品中軟骨藻酸的殘留量；Ci/μg·mL-1為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出試樣溶液中軟骨藻酸的濃度；V1/mL提取液總體積；V2/mL為凈化用提取液體積；V3/mL為洗脫液體積；m/g為樣品重量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取時(shí)間的選擇

設(shè)計(jì)超聲波提取時(shí)間分別為2、3、5、7、10 min，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)提取5 min時(shí)，提取接近完全，延長提取時(shí)間意義不大，故選取提取時(shí)間為5 min。

2.2 離子交換柱類型以及過柱條件的選擇

(1)柱子類型：分別自行生產(chǎn)的I、II、III型陰離子交換柱，取適量提取液過柱凈化洗滌后，用2 mL冰乙酸甲醇溶液洗脫；處理洗脫液后上高效液相色譜檢測，以檢驗(yàn)離子交換柱的凈化效率，結(jié)果見表1，I型陰離子交換柱凈化效果最佳。

表1 DA在不同離子交換柱的凈化效果Tab.1 DA is purified by different anion exchange cartridges

(2)柱pH：用氨水調(diào)節(jié)提取液pH為7、9、11、14，過柱后收集洗脫液上機(jī)檢測；結(jié)果表明：隨著pH的升高，柱子上保留的雜質(zhì)量也相應(yīng)升高，嚴(yán)重影響檢測。

(3)過柱體積：設(shè)定過柱的提取液體積分別為3、5、8、10、15 mL，過柱后收集洗脫液上機(jī)檢測；試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：過柱提取液的體積過高或過低，都影響柱子的保留效率，體積過低及過高還會導(dǎo)致部分雜質(zhì)保留在柱體上，影響檢測結(jié)果。

(4)洗脫液的體積：試驗(yàn)表明，2 mL洗脫液基本能將柱子上吸附的目標(biāo)物質(zhì)完全洗脫下來，增加洗脫液的體積意義不大。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

配制了乙腈+0.1%三氟乙酸+0.02%庚烷磺酸鈉、0.1%三氟乙酸+乙腈+甲醇和0.1%三氟乙酸+乙腈+0.5%庚烷磺酸鈉溶液三種流動相，后2種峰形和分離度較差，因此采用乙腈+0.1%三氟乙酸+0.02%庚烷磺酸鈉作為實(shí)驗(yàn)的流動相。

2.4 方法的精密度、線性關(guān)系

圖1 軟骨藻酸標(biāo)品、空白樣品、加標(biāo)樣品的高效液相色譜圖，保留時(shí)間17.732 minFig.1 Chromatogram of DA standard,blank sample,spiked ample by HPLC,RT=17.732 min

配成濃度為0.1、1.0、2.5、10.0、25.0 μg/mL 的軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，進(jìn)樣20 μL，軟骨藻酸的保留時(shí)間約為17.732 min，測量峰面積，計(jì)算平均值，求得回歸方程Y=0.010 975 x+0.009 456，r=0.999 9，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.3%、4.8%、5.7%、3.9%、5.9%，平均為5.3%。

2.5 樣品測定回收率試驗(yàn)

稱取兩批貝肉，在其中加入不同濃度的軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)品。各稱取5.0 g，按照1.3樣品處理中步驟進(jìn)行，高效液相色譜儀檢測定量。檢測4組不同添加濃度的貝肉，計(jì)算測定方法回收率、精密度和檢測下限，結(jié)果見表2。DA標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品、空白樣品添加色譜圖如圖1所示。

表2 樣品中添加回收率及方法的精密度試驗(yàn)(n=5)Tab.2 Results of recovery test and precision of the method from fortified samples(n=5)

3 結(jié)論

綜上所述，為檢測貝類產(chǎn)品中的記憶缺失性貝類毒素軟骨藻酸，采用甲醇水溶液進(jìn)行提取，經(jīng)過陰離子交換柱凈化，正己烷萃取等處理，使用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。前處理時(shí)間短，處理后的樣品中雜質(zhì)少，該方法可達(dá)到下限200 μg/kg，準(zhǔn)確度和精密度等性能指標(biāo)符合相關(guān)要求，適用于貝類食品的檢測。

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