鄭建博 王麗娜 宋其義 李繼遙 牛衛(wèi)東

（1.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔內(nèi)科教研室，大連 116044；2.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)；3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 牙體牙髓病科，成都 610041）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是根管治療失敗患牙內(nèi)最常見的細(xì)菌之一，被認(rèn)為是導(dǎo)致根管治療失敗的一個(gè)重要因素[1]。在根管充填完善但仍有持續(xù)根尖損害的根管中，糞腸球菌的感染率為24%～77%[2]。該菌不僅可以單獨(dú)引起根管內(nèi)感染，而且可以與其他細(xì)菌混合引起根管內(nèi)感染。糞腸球菌對(duì)常用的根管滅菌藥物及抗菌藥物有極強(qiáng)的抵抗力，臨床醫(yī)師往往很難用傳統(tǒng)的治療方法將定植于根管中的糞腸球菌徹底清除。

細(xì)菌生物膜是由多個(gè)細(xì)菌不可逆地黏附于機(jī)體或物體表面而形成，細(xì)菌被自身細(xì)胞分泌的基質(zhì)所包被，能表達(dá)一套和浮游狀態(tài)下不同的基因。生物膜結(jié)構(gòu)有助抵御外界因素如抗菌劑的影響，對(duì)細(xì)菌有保護(hù)作用并使細(xì)菌具有更強(qiáng)的致病性[3]。研究[4]表明：人類的細(xì)菌感染與生物膜有關(guān)，生物膜具有極高的耐藥性和免疫逃逸能力，這一特性是許多細(xì)菌感染難以根除的重要原因之一。生物膜狀態(tài)下的糞腸球菌具有更強(qiáng)的存活力和致病性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

96孔、12孔平底組織培養(yǎng)板（Corning公司，美國），BA瓊脂培養(yǎng)基，胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（trypticase soy base，TSB），甲醇，無水乙醇，純甘油。MEISHENG型高頻牙科X線機(jī)（上海西域科技有限公司），Multiskan MK3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（北京平利洋醫(yī)療設(shè)備有限公司），JSM-6360LV型掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）（日本電子株式會(huì)社）。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

2008年10月—2009年5月于四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院門診收集根管治療失敗、需要根管再治療患者根管內(nèi)的細(xì)菌，共收集53例糞腸球菌臨床株，-20℃保存于50%的甘油中[5-7]。

1.3 病史的采集[8]

詳細(xì)記錄每位患者的基本信息（包括姓名、性別、年齡、牙位、初診時(shí)間、初診原因），每顆患牙的癥狀和體征（包括是否存在自發(fā)痛、咬合痛、叩痛，是否有牙齦膿腫和瘺道），以及X線檢查情況（包括根尖陰影的直徑和原根管充填情況，是超填、欠填還是恰填）。

1.4 糞腸球菌生物膜形成的檢測(cè)[9]

糞腸球菌在BA瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)蘇、傳代、分離純化后，取一個(gè)單菌落接種至TSB中。將在TSB中培養(yǎng)18～24 h的糞腸球菌調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度，用含有0.25%葡萄糖的新鮮TSB按1∶100稀釋，取200μL接種在96孔無菌平底組織培養(yǎng)板中，35℃靜置培養(yǎng)24h。用PBS（pH=7.2）緩沖液洗板3次除去浮游糞腸球菌，倒置干燥后用甲醇固定15min，1%結(jié)晶紫染色15min，水洗至無色，以無水乙醇溶解結(jié)晶紫，在570 nm波長處讀取各孔光密度（optical density，OD）值。以TBS作為空白對(duì)照，每個(gè)菌株做3個(gè)復(fù)孔，同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并計(jì)算出OD570nm的平均值。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，菌株生物膜形成能力分為4類[10]：OD570nm≤1為陰性（-），即無生物膜形成；1＜OD570nm≤2為弱陽性（+）；2＜OD570nm≤3為中等陽性（++）；OD570nm＞3為強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 生物膜的SEM觀察

選擇糞腸球菌生物膜形成能力陽性和陰性的菌株各1株，在12孔板上建立糞腸球菌生物膜模型。將糞腸球菌接種在TSB中配制成0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度的菌懸液，37℃過夜培養(yǎng)。用含有0.25%葡萄糖的新鮮TSB按1∶100稀釋，取2mL接種于已放入聚氯乙烯圓片的12孔平底組織培養(yǎng)板中，35℃靜置培養(yǎng)24 h后用PBS去除表面的浮游菌，用2.5%戊二醛溶液固定。95%乙醇與叔丁醇聯(lián)合梯度脫水后，將聚氯乙烯圓片裝入樣品盒中置于CO2臨界點(diǎn)干燥儀中干燥2 h。噴金5min后，進(jìn)行SEM觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，分析生物膜形成能力與臨床癥狀之間的關(guān)系，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌形成生物膜的能力

對(duì)53株糞腸球菌的臨床分離株進(jìn)行生物膜形成能力檢測(cè)，其結(jié)果見表1。以O(shè)D570nm＞1為生物膜形成陽性，53株中陽性菌株有40株（75.47%），陰性菌株有13株（24.53%）。

表1 臨床分離糞腸球菌的生物膜形成能力Tab 1 Biofilm formation of Enterococcus faecalis from clinical isolated

2.2 生物膜的SEM觀察

圖1為形成能力不同的糞腸球菌培養(yǎng)24 h后生物膜的形成情況。生物膜形成能力陽性的菌株可見細(xì)菌密集生長，多個(gè)微菌落互相融合且聚集在一起形成膜狀集落，生物膜表面形成很多空隙，并有一定的厚度；形成能力陰性的菌株細(xì)菌多散在分布，數(shù)量明顯少于生物膜形成能力陽性的菌株，微菌落不能互相融合形成膜狀結(jié)構(gòu)。

2.3 生物膜形成能力與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性分析

患牙的臨床癥狀與糞腸球菌生物膜形成能力的相關(guān)分析見表2。對(duì)表2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，四格表χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示：瘺道與再治療根管糞腸球菌生物膜形成有相關(guān)性，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；自發(fā)痛、咬合痛、叩痛、牙齦膿腫、根尖暗影等其他臨床表現(xiàn)與再治療根管糞腸球菌生物膜形成的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在再治療根管中，無瘺道的患牙分離出來的糞腸球菌生物膜形成能力強(qiáng)于有瘺道的患牙。

表2 糞腸球菌生物膜形成能力與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性分析Tab 2 Correlation analysis for Enterococcus faecalis biofilm formation ability and clinicalmanifestation

3 討論

糞腸球菌呈圓形或橢圓形，直徑0.5～1.0μm，大多數(shù)成對(duì)或短鏈狀排列，通常情況下不運(yùn)動(dòng)。該菌對(duì)營養(yǎng)要求低，在普通培養(yǎng)基上也可以生長，能在10℃或45℃、pH=9.6或含6.5%NaCl的肉湯培養(yǎng)基中生長，并能耐受65℃ 30min。它可利用精氨酸為能源，發(fā)酵山梨醇，不發(fā)酵阿拉伯糖；可水解七葉苷，與檸檬酸鐵銨中的鐵離子反應(yīng)形成黑色的6,7-二羥基香豆素。

許多人類的細(xì)菌感染與生物膜有關(guān)，生物膜具有極高的耐藥性和免疫逃逸能力，生物膜內(nèi)細(xì)菌較其浮游狀態(tài)時(shí)對(duì)抗生素的耐藥性高100～1000倍[11]，這一特性是許多細(xì)菌感染難以根除的重要原因之一。

根管內(nèi)的糞腸球菌主要以生物膜形式存在。已有實(shí)驗(yàn)[12-13]證實(shí)：糞腸球菌的耐藥性與該菌生物膜形成存在相關(guān)性。有關(guān)生物膜的研究技術(shù)主要包括以下幾點(diǎn)。1）生物膜發(fā)生裝置。它是研究生物膜的首要工具，主要有以下4種：①試管法培養(yǎng)生物膜，簡便、靈活、較常用；②微孔板法，常用96孔板或384孔板，具有批處理優(yōu)勢(shì)，常應(yīng)用于考察藥物對(duì)生物膜的作用；③置片法，生物膜靜態(tài)培養(yǎng)于玻璃、硅膠或金屬等管狀或片狀物上，具有直觀及可移動(dòng)處理的特點(diǎn)；④管路法、流室法等，均屬于動(dòng)態(tài)造膜法，更能模擬生物膜的形成。2）生物膜檢測(cè)技術(shù)。主要有：①染色法，常用結(jié)晶紫或沙黃等染料對(duì)生物膜中的成分染色后，用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀定量測(cè)定，適用于試管法或96孔微板法；②菌體計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)生物膜中的菌體進(jìn)行量化測(cè)定；③熒光法，用不同顏色的熒光染料區(qū)分生物膜內(nèi)的死菌與活菌；④顯微鏡技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)參考以上各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，同時(shí)參考了許多相似的文獻(xiàn)，采用96孔板建立糞腸球菌生物膜的體外模型，結(jié)合結(jié)晶紫染色和酶標(biāo)儀讀數(shù)，對(duì)臨床分離的糞腸球菌生物膜形成能力進(jìn)行半定量分析，同時(shí)采用SEM對(duì)生物膜形成能力為陽性和陰性的細(xì)菌進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果表明：絕大多數(shù)（75.47%）臨床分離的糞腸球菌有一定的形成生物膜的能力，其中有7株生物膜形成能力較強(qiáng)。此方法可以對(duì)細(xì)菌生物膜形成能力進(jìn)行可靠分析，即可定性又可定量，方法準(zhǔn)確、高效、簡便，可用于臨床菌株生物膜形成能力的分析，也可為下一步研究細(xì)菌生物膜的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)不同的臨床表現(xiàn)與糞腸球菌生物膜形成能力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：瘺道與再治療根管糞腸球菌生物膜形成有相關(guān)性，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），自發(fā)痛、咬合痛、叩痛、牙齦膿腫、根尖暗影等其他臨床表現(xiàn)與再治療根管糞腸球菌生物膜形成的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在再治療根管中，無瘺道的患牙分離出來的糞腸球菌形成生物膜的能力要強(qiáng)于有瘺道的患牙分離出來的糞腸球菌形成生物膜的能力。該結(jié)果提示：對(duì)于再治療的根管，在有糞腸球菌檢出的情況下，無瘺道的患牙應(yīng)給予足夠的重視，由于其生物膜形成能力較強(qiáng)，應(yīng)采取更加有針對(duì)性的沖洗液和抗生素，抑制和瓦解糞腸球菌的生物膜，防止根管治療再次失敗。

一旦生物膜形成，抗生素就難以滲透進(jìn)入殺死細(xì)菌，造成感染遷延不愈，預(yù)后較差。目前主要通過抑制細(xì)菌生物膜的形成和通過殺菌劑作用于已形成穩(wěn)態(tài)的生物膜兩方面來進(jìn)行防治。但是，細(xì)菌生物膜相關(guān)感染的防治仍是臨床上一個(gè)亟待解決的難題，因?yàn)槟壳皯?yīng)用的抗菌藥物并不能完全清除細(xì)菌生物膜。目前除了應(yīng)用抗生素治療細(xì)菌生物膜導(dǎo)致的相關(guān)感染外，還發(fā)現(xiàn)了許多其他可能有效的方法，但尚不成熟，有待于進(jìn)行更加深入的探索。

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