姚軍 張佳麗

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 兒童牙科，福州 350002）

赤蘚糖醇是一種具有極低熱量值[1]的糖醇類食品，目前對(duì)赤蘚糖醇的研究多集中在其低熱量、高耐受性等方面，還未將赤蘚糖醇廣泛的應(yīng)用于防治齲病方面。國內(nèi)外研究表明：赤蘚糖醇可以抑制變異鏈球菌的生長[2-4]，具有防齲的作用[5]。但關(guān)于赤蘚糖醇對(duì)變異鏈球菌的抑菌機(jī)制尚未完全明了。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定在蔗糖和赤蘚糖醇條件下變異鏈球菌所在的液體培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活性，以及在掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）下觀察赤蘚糖醇作用后變異鏈球菌表面的形態(tài)變化，了解赤蘚糖醇對(duì)變異鏈球菌表面結(jié)構(gòu)的影響，從而探討赤蘚糖醇的抑菌機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 菌株和主要試劑

變異鏈球菌國際標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25175（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院齲病研究室惠贈(zèng)），雙蒸水（福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室制造），蔗糖（分析純，分子式C12H22O11，相對(duì)分子質(zhì)量為342.29，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心），赤蘚糖醇（分子式C4H10O4，相對(duì)分子質(zhì)量為122.12，山東省保齡寶生物股份有限公司），木糖醇（分子式C5H12O5，相對(duì)分子質(zhì)量為152.15，天津市福晨化學(xué)試劑廠）。TPY液體培養(yǎng)基（1.5%胰蛋白胨、0.4%酵母提取物、1%葡萄糖、0.6%磷酸二氫鉀、0.2%碳酸鈉、0.2%氯化鈉、0.2%磷酸氫二鉀、雙蒸水）調(diào)節(jié)pH值到7.0，高壓滅菌。TPY固體培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基中加入1.25%瓊脂）高壓滅菌。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

厭氧培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），超凈工作臺(tái)（上海力申科學(xué)儀器有限公司），電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），SEM（飛利浦公司，荷蘭），臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（Heraeus公司，德國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 變異鏈球菌的復(fù)蘇和純化 將在甘油中保存的變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株接種至TPY固體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃厭氧（80%N2、10%CO2、10%H2）條件下培養(yǎng)24 h。取上述復(fù)蘇的標(biāo)準(zhǔn)株單個(gè)菌落接種于TPY固體培養(yǎng)基內(nèi)，相同條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 LDH活性測(cè)定 將實(shí)驗(yàn)分為蔗糖組、木糖醇組和赤蘚糖醇組，濃度均為8%，每組3個(gè)試管。各取200μL菌液分別加入含上述成分的TPY液體培養(yǎng)基（各20mL）中，各組均置入37℃厭氧環(huán)境（80%N2、10%CO2、10%H2）中培養(yǎng)24 h后，3 500·min-1離心10min，用微孔濾膜（0.22μm）過濾除去細(xì)菌后取其上清液，用全自動(dòng)生化分析儀分別測(cè)定各個(gè)試管上清液中LDH的活性，其原理是基于酶對(duì)光的選擇性吸收，即分光光度法。酶的活性用光密度值來表示，也反映了各試管中酶的濃度。

1.3.3 蔗糖和赤蘚糖醇作用前后變異鏈球菌形態(tài)學(xué)的SEM觀察 將實(shí)驗(yàn)分為2組，分別為8%蔗糖組和8%赤蘚糖醇組，細(xì)菌的培養(yǎng)條件如上。在試管中放入1 cm×1 cm大小的蓋玻片，每管加入菌液100μL及添加有蔗糖或赤蘚糖醇的TPY培養(yǎng)基4mL。在37℃厭氧環(huán)境（80%N2、10%CO2、10%H2）中培養(yǎng)8 h后，小心棄菌液，取出蓋玻片，2%戊二醛固定1 h，乙醇梯度脫水30min[6]，干燥，噴金，SEM下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行多樣本均數(shù)多重比較的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 赤蘚糖醇對(duì)變異鏈球菌LDH的影響

變異鏈球菌分別在蔗糖、木糖醇和赤蘚糖醇的TPY培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，上清液中LDH的含量分別為（0.2±0.1）、（3.2±0.1）、（3.2±0.1）IU·L-1。在蔗糖組，上清液中LDH的量與其他兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但這種差異在臨床實(shí)驗(yàn)中卻很??；木糖醇組與赤蘚糖醇組相比較，上清液中LDH的量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 蔗糖和赤蘚糖醇作用前后變異鏈球菌形態(tài)學(xué)的SEM觀察結(jié)果

在蔗糖和赤蘚糖醇作用后，SEM下觀察變異鏈球菌的表面形態(tài)結(jié)果見圖1、2。由圖1、2可見，在5000倍鏡下，蔗糖組細(xì)菌分布總體較稠密，有部分區(qū)域呈團(tuán)塊狀，赤蘚糖醇組細(xì)菌分布總體較為稀疏。在10 000、20 000倍鏡下，蔗糖組和赤蘚糖醇組中均可見變異鏈球菌外形清晰，細(xì)菌表面光滑，無缺損，沒有內(nèi)容物溢出的跡象。

3 討論

赤蘚糖醇的防齲功能已經(jīng)被初步證實(shí)，其抑制變異鏈球菌的作用也已經(jīng)得到初步的肯定，但關(guān)于其抑菌機(jī)制尚未完全明了，可以從以下幾個(gè)方面推測(cè)考慮。

3.1 對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)胞壁和細(xì)胞膜都是細(xì)菌的重要結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁能維持細(xì)胞的正常形態(tài)和進(jìn)行物質(zhì)交換，保持細(xì)胞內(nèi)的高滲壓；而細(xì)胞膜位于細(xì)胞壁內(nèi)層，由脂質(zhì)雙分子層和蛋白質(zhì)組成，具有滲透屏障和選擇性物質(zhì)運(yùn)輸?shù)裙δ?。一旦?xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)容物就會(huì)大量溢出，所以可以用細(xì)菌的培養(yǎng)上清液中細(xì)胞內(nèi)酶的含量來作為判斷細(xì)胞壁和細(xì)胞膜是否完整的一個(gè)重要的指標(biāo)。

LDH是變異鏈球菌等細(xì)菌內(nèi)的固有酶，該酶總以高濃度存在于細(xì)胞內(nèi)，是變異鏈球菌代謝過程中一種重要的酶。LDH可以通過其催化作用，調(diào)節(jié)菌斑酸的代謝，維持菌斑生態(tài)平衡，并對(duì)抗由環(huán)境中糖濃度突然增加而引起的菌細(xì)胞死亡[7]。因?yàn)檫@些酶主要存在于細(xì)胞內(nèi)，而在培養(yǎng)基內(nèi)較少，所以本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定變異鏈球菌培養(yǎng)上清液中LDH的濃度來判定赤蘚糖醇對(duì)該細(xì)菌細(xì)胞壁以及細(xì)胞膜的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：加入赤蘚糖醇后培養(yǎng)上清液中LDH的濃度比加入蔗糖時(shí)高，但這種差異很小，在臨床實(shí)驗(yàn)中幾乎可以忽略，這提示只有極少量變異鏈球菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性被破壞。掃描電鏡下也見在蔗糖或赤蘚糖醇條件下，大多數(shù)變異鏈球菌的表面形態(tài)并沒有很大的不同，細(xì)菌表面光滑，無缺損，并沒有看見有內(nèi)容物的溢出?？梢酝茰y(cè)，赤蘚糖醇對(duì)變異鏈球菌的抑制作用主要不是通過對(duì)變異鏈球菌細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜的直接破壞來實(shí)現(xiàn)的。

3.2 干擾細(xì)菌內(nèi)正常的生理代謝

根據(jù)木糖醇抑制細(xì)菌作用的機(jī)制來推測(cè)其抑菌機(jī)制主要為以下幾個(gè)方面：首先變異鏈球菌的磷酸烯醇式丙酮酸依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphoenolpyruvic acid-phosphotransferase system，PEP-PTS）可以將赤蘚糖醇轉(zhuǎn)移至細(xì)菌體內(nèi)，同時(shí)對(duì)該酶的占用也抑制了細(xì)菌對(duì)葡萄糖的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。其次，赤蘚糖醇在細(xì)菌體內(nèi)被磷酸化的產(chǎn)物堆積，抑制變異鏈球菌的生長。再次，赤蘚糖醇可能會(huì)在細(xì)菌體內(nèi)產(chǎn)生“磷酸—脫磷酸”這種無效的循環(huán)，導(dǎo)致大量的磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvic acid，PEP）被消耗，而PEP是合成三磷酸腺苷的原料和PEP-PTS系統(tǒng)的能量來源，這就導(dǎo)致了細(xì)菌生長的抑制。最后可以從分子生物學(xué)角度探究。研究發(fā)現(xiàn)：木糖醇可以干擾變異鏈球菌的蛋白合成及熱休克蛋白-60、70的表達(dá)，進(jìn)而影響變異鏈球菌的生長[8]。還可從對(duì)變異鏈球菌分子蛋白合成影響方面來探索赤蘚糖醇的抑菌機(jī)制。

3.3 阻止其他營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入菌體

赤蘚糖醇的存在抑制了變異鏈球菌對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，因?yàn)槠湔加昧宿D(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的轉(zhuǎn)移酶。另一方面當(dāng)葡萄糖被吸收時(shí)，易被變異鏈球菌的特異性葡糖基轉(zhuǎn)移酶、果糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為胞外多糖，形成葡聚糖和果聚糖。其中不溶性葡聚糖具有黏性，能抵抗口腔細(xì)菌的降解，是構(gòu)成菌斑基質(zhì)的主要成分。它能促進(jìn)細(xì)菌在牙面的集聚，促進(jìn)菌斑的形成。而且其可以改變菌斑的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，使菌斑成為多孔性結(jié)構(gòu)，有利于葡萄糖溶液滲透進(jìn)入菌斑-釉質(zhì)交界面并被細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)酸，增加菌斑的致齲性[9]。赤蘚糖醇不能被利用產(chǎn)生不溶性葡聚糖，也就不能形成這種多孔性的結(jié)構(gòu)，不利于營養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入。

赤蘚糖醇對(duì)變異鏈球菌的抑制機(jī)制還處在初步探索階段，本實(shí)驗(yàn)只是初步證明赤蘚糖醇對(duì)變異鏈球菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜并沒有很強(qiáng)的破壞作用，其具體的抑菌機(jī)制還需更深入的探討研究。

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