陳海霞 田吉 肖順漢△

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 瀘州646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院藥物與功能性食品研究中心，四川 瀘州646000）

皂角刺（Spina Gleditsiae），為豆科植物皂莢Gleditsia sinensis Lam.的干燥棘刺，始載于《本草綱目》，已被列為抗癌中草藥之一。中藥化學(xué)成分含黃酮、皂苷、三萜、氨基酸等，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有抗癌作用的部分主要是黃酮類化合物［1－2］?？傸S酮含量測定的方法［3－4］主要有紫外可見分光光度法：測定含量時，樣品中加入顯色劑生成有色金屬絡(luò)合物，作用在光譜上能出現(xiàn)明顯的吸收峰，這種紫外可見分光光度的方法又稱為比色法。薄層掃描法是在樣品經(jīng)薄層分離后，在特定波長下用光度計直接測定其吸光度。隨著科技的發(fā)展，還有其他如制備高效液相色譜法、熒光分光光度法、毛細(xì)管電泳法等廣泛用于黃酮的含量測定。本文在參考諸多文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)有條件，利用比色法測定皂角刺總黃酮含量，為評價黃酮類及其制品的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材與樣品

皂角刺干藥材購于瀘州百草堂飲片公司，由瀘州醫(yī)學(xué)院生藥教研室稅丕先老師鑒定。皂角刺總黃酮粗提物：取12kg皂角刺干藥材，用粉碎機(jī)充分粉碎，打粉（20－30目），以8倍量（m∶v＝1∶8，g·mL－1）的50%乙醇加熱回流提取兩次［5－6］，每次1h，合并回流液并減壓濃縮，回收乙醇溶劑，減壓干燥，得0.48kg皂角刺干浸膏，放入干燥器緩慢烘干備用。皂角刺總黃酮純化物：皂角刺總黃酮粗提物經(jīng)聚酰胺純化工藝獲得。

1.2 試劑與儀器

蘆丁對照品 （Purity≥98%，成都曼斯特生物有限公司），水為本院藥研所自制純凈水。乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等均為分析純。電子天平 （FA1604N，0.1mg，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司），紫外分光光度計（UV－2100，北京瑞利分析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品5.3mg，至25 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解，搖勻定容至刻度，即得濃度為0.21mg·mL－1的對照品溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

（1）精密稱取皂角刺總黃酮粗提細(xì)粉0.1076g至25mL容量瓶中，加50%乙醇溶解，搖勻定容至刻度，即得濃度為4.2mg·mL－1的樣品溶液。（2）精密稱取皂角刺總黃酮純化細(xì)粉0.0463g至10mL容量瓶中，加50%乙醇溶解，搖勻定容至刻度，即得濃度為4.6mg·mL－1的樣品溶液。

1.3.3 檢測波長的選擇

精密吸取蘆丁對照品溶液3mL，至10mL具塞試管中，加入5%的NaNO2溶液0.3mL，搖勻后放置6min，加入10%的Al（NO3）3溶液0.3mL，搖勻后放置6min，再加入1moL·L－1NaOH溶液4mL，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15min。置于比色皿中，以試劑空白作為參比［7］，照分光光度法，在200～900nm波長的范圍內(nèi)掃描，選擇吸光度值最大時的波長為蘆丁對照品的最大特征吸收波長。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密 吸 取 蘆 丁 對 照 品 液 0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，分別置于10mL具塞試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁試液0.3mL，搖勻，放置6min，加1moL·L－1氫氧化鈉試液4mL，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min，以第一份作為空白，于510nm波長處測定吸光度。

1.3.5 精密度試驗

取同一供試品溶液5份，每份精密吸取0.2mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法測定含量。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗

［8］，精密吸取同一供試品溶液，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法，每隔10min測定一次吸光度A值，連續(xù)測定至第60 min。

1.3.7 重復(fù)性試驗

取同一皂角刺總黃酮樣品5份，每份0.1076g，精密稱定，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法測定含量。

1.3.8 加樣回收率試驗

精密稱取樣品（總黃酮粗提物，含量為58.84%）0.0538g，6份，編號1～6，1、2號（按樣品黃酮含量∶對照品＝1∶0.8）加入蘆丁對照品25.33mg，3、4號（按樣品黃酮含量∶對照品＝1∶1）加入蘆丁對照品31.66mg，5、6號（按樣品黃酮含量∶對照品＝1∶1.2）加入蘆丁對照品37.99mg。依法制備供試品溶液，并按含量測定項下方法測定，按公式計算回收率，回收率＝（實測黃酮含量－樣品中黃酮含量）／黃酮對照品加入量×100%。

1.3.9 樣品含量測定

精密吸取皂角刺總黃酮粗提物溶液0.2mL，置于10mL具塞試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁試液0.3mL，搖勻，放置6min，加1moL·L－1氫氧化鈉試液4mL，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min。置于比色皿中，以試劑空白作為參比，照分光光度法，于510nm波長處測定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及計算公式，計算出皂角刺總黃酮粗提物的含量。

按上述方法，精密吸取皂角刺總黃酮純化物溶液0.1mL，于510nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及計算公式，計算出皂角刺總黃酮純化后的含量。黃酮含量（%）＝（測出質(zhì)量／取樣體積×供試品總體積）／供試樣品總質(zhì)量×100%

2 結(jié)果

2.1 檢測波長的確定

總黃酮樣品溶液和對照品溶液顯色后兩者的峰型相似，在510nm處均有一個強(qiáng)吸收峰，結(jié)果表明，蘆丁對照品在510nm處有最大吸收峰，故將510nm作為總黃酮的檢測波長，見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和總黃酮樣品溶液吸收光譜

2.2 線性關(guān)系考察

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，顯色測定以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法得出回歸方程為y＝1.1939x－0.0068，r＝0.9999，表明樣品濃度在0.053～0.848 mg范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好，見圖2。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度試驗

由表1可知，五次測定吸收度的平均值為0.4455，每個樣品測定的A值變化很小，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.11%，表明儀器的精密度良好。RSD%＝S／X×100%，其中S為標(biāo)準(zhǔn)偏差，X為測量平均值。

表1 精密度試驗

2.4 穩(wěn)定性試驗

實驗表明在30min內(nèi)吸收度（A）值保持穩(wěn)定，60min后吸收度（A）值下降約9%，因此顯色后應(yīng)在30min內(nèi)測定吸光度。

表2 穩(wěn)定性試驗

2.5 重復(fù)性試驗

由表3可知，平均含量為58.50%，RSD為2.40%，表明本品重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗

2.6 加樣回收試驗

從表4可見，總黃酮平均回收率為96.7%，RSD為2.02%（＜3%），表明該方法不存在系統(tǒng)誤差，可以作為皂角刺總黃酮含量的測定方法。

表4 加樣回收試驗

2.7 樣品含量測定

由表5可見，經(jīng)聚酰胺柱二次吸附、洗脫后，總黃酮含量從58.84%提高到了81.84%。

表5 皂角刺總黃酮含量測定

3 討論

黃酮類物質(zhì)是廣泛存在于植物中的一類黃色素，在氧化劑亞硝酸鹽存在的情況下，與硝酸鋁生成黃色的黃酮鋁絡(luò)合物，遇堿呈紅色，在可見光內(nèi)出現(xiàn)穩(wěn)定的吸收峰［9］，故本實驗用紫外可見分光光度法（比色法）［10，11］測定皂角刺總黃酮含量。該法具有設(shè)備簡單、適用性廣、準(zhǔn)確度和精密度較好等特點，在中藥總黃酮含量分析中發(fā)揮著重要作用。在實際生產(chǎn)和科研過程中，高效液相色譜法（HPLC）適用于黃酮單體含量的測定，靈敏度高，但儀器價格昂貴；薄層掃描法操作麻煩，可行性差。

在對總黃酮比色法含量測定過程中，注意消除顯色劑或供試液本身顏色可能存在的干擾。如果制得的待測液有不溶物析出，應(yīng)考慮改變?nèi)苊降谋壤螂x心，使待測液澄明，以保證測得的吸收度值穩(wěn)定［12］。

本實驗中所采用的標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁只是一種典型的黃酮類化合物，并不能代表皂角刺中的黃酮類化合物，但由于它與皂角刺中的黃酮類化合物在分別經(jīng)顏色反應(yīng)后，于510nm處均有最大值，因此可以利用其顏色反應(yīng)在可見分光光度計下繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以測定總黃酮含量。今后可嘗試以皂角刺中有代表性的黃酮類化合物如槲皮素等為標(biāo)準(zhǔn)品，利用HPLC對皂角刺總黃酮進(jìn)行定量分析。

參考文獻(xiàn)

1 陳鳳秀，尉艷霞，潘虹，等.洋蔥黃酮類物質(zhì)對人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.中藥藥理與臨床，2008，24（5）：36－39.

2 趙新漢，王志宇，李晶，等.槲皮素誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞K562的凋亡［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2006，27（15）：1395－1398.

3 金蕾.NaNO2－Al（NO3）3－NaOH 法測定總黃酮含量的實驗條件研究［J］.海峽藥學(xué)，2008，20（5）：66－67.

4 郭雪峰，岳永德.黃酮類化合物的提取·分離純化和含量測定方法的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（26）：8083－8086.

5 李萬華，李琴，王小剛，等.皂角刺中黃酮類化學(xué)成分的分離鑒定［J］.西北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，35（6）：763－765.

6 曹學(xué)鋒，郭澄，張俊平.皂角刺總黃酮對小鼠細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2002，13（10）：588－589.

7 許剛，張虹.竹葉中黃酮提取方法的研究［J］.分析化學(xué)，2000，28（7）：857－859.

8 羅蘭，郭麗冰，曾常青.大山楂丸中總黃酮的含量測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18（9）：2207－2208.

9 田洪磊，田呈瑞，詹萍.玉米苞葉總黃酮提取工藝研究［J］.糧食與油脂，2006，17（1）：24－26.

10 任順成，丁霄霖.玉米須黃酮類測定方法的研究［J］.食品科學(xué)，2004，24（3）：139－142.

11 管軍軍，方希修.大豆異黃酮測定方法概述［J］.西部糧油科技，2003，28（6）：59－61.

12 鄭杭生，李計萍，韓煒，等.紫外－可見分光光度法測定總黃酮含量的方法學(xué)考察要點［J］.中成藥，2008，30（9）：1364－1365.