劉榮寧，趙曉改，趙振利，范國強*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學，河南 鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，河南 中牟 451450)

懸鈴木具有耐修剪整形、生長迅速、隔離噪音、抗煙和抗塵的能力，特別對SO2、Cl2等有毒氣體有較強的抗性，對城市環(huán)境有極強的適應能力，且有“行道樹之王”的美稱，故世界各國廣為種植［1］。SSR標記技術(shù)目前已廣泛用于基因定位、遺傳作圖、多態(tài)性分析、構(gòu)建DNA指紋圖譜等［1－7］各個領(lǐng)域。SSR標記雖具有試驗程序簡單、物種及染色體組特異性等優(yōu)點，但因其擴增過程中有諸多因素的影響，也會產(chǎn)生非特異擴增等問題，從而給研究工作帶來不便。目前，SSR 技術(shù)已在水稻［9］、玉米［10］、柑橘［11］、櫻桃李［12］、泡桐［13］等標記研究中得以應用，但尚未見到有關(guān)懸鈴木SSR體系建立的相關(guān)報道。本實驗旨在通過篩選反應體系中各因素的最佳組合，并進行引物篩選檢驗，建立一套適合懸鈴木基因組SSR－PCR擴增反應體系，并為基因定位及克隆研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

河南農(nóng)業(yè)大學泡桐研究所林木生物技術(shù)實驗室在溫度(25±2)℃，光強130 μmol·m－2·s－1，光照時間16 h·d－1的條件下，培養(yǎng)35 d的三球懸鈴木(Platanus orientalis L.)健康組培苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 懸鈴木基因組DNA的提取 取35 d組培苗的葉片，參照TIANGEN試劑盒說明書提取懸鈴木基因組DNA，利用紫外分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳法檢測所提取的DNA濃度和質(zhì)量，置－20 ℃冰箱保存，用于PCR擴增。

1.2.2 SSR－PCR反應程序設(shè)定 SSR擴增程序:SSR－PCR擴增在Biometra擴增儀上進行。反應程序參照曹喜兵等［13］方法。

1.2.3 SSR－PCR基本反應體系 參照曹喜兵等［13］SSR反應體系建立。對影響PCR擴增結(jié)果的退火溫度、dNTP和引物(5'GCC AGC GAA CTC AAA TCT與3'AAC GAG AAC GAC GAG CG)濃度，Taq酶用量，模板DNA濃度等參數(shù)進行梯度試驗(表1)。當利用一種參數(shù)試驗時，其它參數(shù)保持不變，以便篩選出5種參數(shù)的最佳組合，試驗設(shè)3次重復。

表1 PCR 反應體系中處理因素和水平Table 1 Factor and level of PCR reaction system

1.2.4 PCR產(chǎn)物的電泳及分析 PCR產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。20 μL PCR產(chǎn)物與5.5 μL 加樣緩沖液(49 mL 甲酰胺、1 mL 0.5 mol·L EDTA、0.125 g溴酚藍、0.125 g 二甲苯菁)混合，在95℃變性5 min后，放入4 ℃冰箱冷卻待用。電泳時，每泳道上樣量為5 μL擴增產(chǎn)物，電泳條件為60 W恒功率，電泳時間為30 min。電泳結(jié)束后，凝膠固定、銀染、顯影，并用UMAX PowerLook2100LX型掃描儀掃描凝膠。

1.2.5 引物篩選 參考常莉［14］從其它木本植物篩選出的417對微衛(wèi)星引物，由鄭州寶賽生物科技有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 懸鈴木SSR分子標記反應體系

2.1.1 不同退火溫度對懸鈴木SSR－PCR反應程序的影響 退火溫度對SSR－PCR擴增結(jié)果(圖1)可看出，不同退火溫度對懸鈴木SSR－PCR擴增產(chǎn)物量影響不同。當退火溫度為45、47、50℃時，SSR－PCR擴增出的條帶亮度逐漸明顯增強;當退火溫度為53、55、57℃時，擴增產(chǎn)物電泳條帶逐漸減弱。當SSRPCR擴增引物一定時，懸鈴木擴增產(chǎn)物量隨退火溫度逐漸升高而增大，但當退火達到一定溫度時，SSRPCR擴增量又隨其溫度的增高而下降，因此該研究認為針對引物對ORNL－97適宜的退火溫度選擇為50℃。同時針對不同的引物在進行SSR－PCR反應程序時可根據(jù)引物所標出的退火溫度進行適當調(diào)整，才能達到理想的效果。

2.1.2 不同dNTP濃度對懸鈴木SSR－PCR擴增的影響 不同dNTP濃度對懸鈴木SSR擴增產(chǎn)物量產(chǎn)生了明顯的影響。當 dNTP 濃度分別為0.025、0.05、0.1 和 0.2 mmol·L－1(泳道 1 －4)時，擴增產(chǎn)物電泳后均有譜帶出現(xiàn)，但不同dNTP濃度擴增譜帶的亮度強度存在著差異。其中，0.2 mmol·L－1擴增出的譜帶亮度最強，0.1 mmol·L－1次之，0.05 mmol·L－1較弱，0.025 mmol·L－1最弱。當 dNTP 濃度為0.3 和0.4 mmol·L－1時，擴增產(chǎn)物電泳后逐漸減弱(泳道5和6)。意味著dNTP濃度過低降低SSR－PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，濃度過高又會抑制產(chǎn)物產(chǎn)生，本試驗中，dNTP濃度為0.2 mmol·L－1時，SSR－PCR擴增的譜帶最清晰，故選擇0.2 mmol·L－1作為懸鈴木SSR－PCR擴增的最適濃度。

2.1.3 引物濃度對SSR－PCR擴增的影響 由引物濃度對SSR－PCR擴增結(jié)果(圖3)可以看出，雖然不同引物濃度對SSR擴增產(chǎn)物量的影響不同，但是試驗設(shè)置的6個濃度均可擴增出電泳譜帶。當引物濃度為 0.1、0.2 和0.4 μmol·L－1時，擴增出的譜帶明顯增強(泳道 2、3 和 4)，當濃度分別 0.6 μmol·L－1時，擴增結(jié)果最清楚，故選擇0.6 μmol·L－1作為懸鈴木SSR－PCR擴增的最適濃度。

2.1.4 懸鈴木DNA濃度對SSR擴增的影響 不同濃度懸鈴木DNA的SSR－PCR擴增結(jié)果(圖4)表明，當懸鈴木DNA為0.5ng·μL－1時，譜帶亮度過低(泳道1)，在一定范圍內(nèi)模板DNA濃度對泡桐SSR擴增結(jié)果影響不顯著。雖然懸鈴木DNA濃度由1.0升高到16.0 ng·μL－1，但其SSR擴增出的電泳譜帶亮度差異不大。因此，從擴增產(chǎn)物的穩(wěn)定性和節(jié)省模板用量等方面考慮，我們選擇4.0 ng·μL－1懸鈴木DNA作為其SSR－PCR擴增體系的適宜模板濃度。

2.1.5 Taq酶量對SSR擴增的影響 由不同Taq酶量對SSR－PCR擴增結(jié)果(圖5)的影響可以看出，不同Taq酶量對泡桐SSR擴增產(chǎn)物量產(chǎn)生了較為顯著的影響。在SSR－PCR擴增反應體系中，在一定范圍內(nèi)隨著Taq酶量的逐漸增加，其擴增產(chǎn)物量也逐漸增大，之后，隨著Taq酶量的增加，譜帶亮度和清晰度逐漸降低。在SSR－PCR擴增體系中，我們選用0.05U·μL－1為懸鈴木SSR－PCR擴增體系的最適Taq酶量。

2.2 引物篩選

根據(jù)上述優(yōu)化體系，從其它木本植物的417對SSR引物中篩選出適合懸鈴木SSR擴增的54對引物(表2)。結(jié)果表明，選出的54對引物，所擴增的譜帶清晰、分辨率高、重現(xiàn)性好、多態(tài)性強，是較適宜的擴增體系(圖6)。

表2 懸鈴木SSR擴增引物Table 2 Primers used in the SSR－PCR of the plant

引物編號Primer Codes核苷酸序列(5’－－－3’)Nucleotide sequences(5’－ － －3’)備注References引物編號Primer Codes核苷酸序列(5’－－－3’)Nucleotide sequences(5’－ － －3’)備注References 19 CGG AGG GTG TGC TGC CGA AGGCC CAG CCC ATA TCT GCT ［18］ 46 TTC ATC CTA GCT GCT TGC TTTCTC AGC GTC TAC CCC ATC AA ［23］20 TAT TTC TAC AAC ATA CCA AAA CGCAT TAC TCA AGC ACA TGC ACG C ［23］ 47 CTT GTT GCT GCT TCT GCAAC AAA ATA ATA TAA ATG CTC TGC ［23］21 CAT CCA TGA TAT CAA ACC AAA TTA GTGT AAT CCA AAC ATA AAA TCC CAA G ［23］ 48 CAC GGC CCT TAG CTT TAC CTTTTC TGA TGG GGC AAC TG ［23］22 ACC TCA ATC ATC ATC ACC ATC TTGCG CTG AAA TGA TCA TAA TGT AG ［23］ 49 TTG GGC GCC TCT TGC TCG TCT TCAAGC ATG CGT GGT GGT CTC GTC AGC ［23］23 TGT ATC CCC TCC TCG GAT AAGGC ATT AAT GGA TGA TGA TGA ［24］ 50 AGG CCG AGC AAG ATG ACG ACG ATACGT TCG ACA GCG GCT CTT CAA AAG ［23］，24 AAT TAA CTC CAA CAG CTC CAATG GTT GCT TAA TTC AAT GG ［24］ 51 GAC GAC ATG ACG AGG GAG GAAGCA CTA TGG GCG CAC TAC ACA ［23］，25 AAG CAA AGT CCA TAA AAA CGCGGA CGA AGA CGC TCC ATT ［25］ 52 CCT GCA AGG GTA TTT GGG TTT ACGTTC GTT GGC CCC AAA TAC TTC AAT ［23］，26 TGC AGG TGA TGT CAT CAC CGAAC CGA ATC CAT GCG TCA CC ［23］ 53 ATT TAG TTA TGA TCT GGT TTT TAAG CTA TTA TAA TCA TTT CTC ACA ［23］，27 ACG TAT ATG AAG TTC TTG ATT GCGAC AGA TCA TTA TGA TTA CTA CAG ［23］ 54 TTT GGC AAA AGA ACA TTG AGA TATA TTG GTA TTA GTT GAA GTT ［23］，

圖6 懸鈴木54對引物的SSR擴增圖Fig.6 Gel electrophoresis of the SSR products with 54 pairs of the plant

3 結(jié)論與討論

SSR－PCR標記具有多態(tài)性高、試驗重復性好和共顯性遺傳的特點，雖然廣泛用于農(nóng)作物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、植物分類和進化及遺傳多樣性［2－13］等方面，但對于不同植物SSR標記的技術(shù)體系有所不同。該試驗采用了先構(gòu)建基本反應體系，再在基本反應體系中進行單因素梯度優(yōu)化試驗的方法，既節(jié)約了成本，又有的放矢的針對每一個因素。本實驗對影響SSR擴增效果的退火溫度等5個參數(shù)的篩選，建立的最適懸鈴木SSR－PCR擴增體系為，20 μL的反應體系中，包括懸鈴木4.0ng·μL－1DNA，0.2 mmol·L－1dNTP，0.6μmol·L－1引物，0.05 U·μL－1Taq 酶，退火溫度為 50 ℃。

影響PCR擴增效果的因素多種多樣，引物退火溫度就是其中之一［1－14］。在利用SSR分子標記技術(shù)開展新植物DNA堿基序列變化研究中，需要進行大量的引物篩選工作。雖然每對引物都有其理論的退火溫度，但是適宜的理論退火溫度不能得到理想的擴增效果。通用SSR－PCR擴增需要對每一對引物進行適宜退火溫度的篩選［1－14，16］，工作單調(diào)而繁重。因此，本試驗采用TD－PCR技術(shù)建立起來的懸鈴木SSR－PCR分子標記反應體系可以在懸鈴木相關(guān)研究中兼顧大部分引物對退火溫度的要求，使引物篩選工作能夠快速準確的進行，從而避免煩瑣引物退火溫度的篩選工作。至于該反應體系在懸鈴木現(xiàn)代生物技術(shù)研究中的應用情況將在后續(xù)的論文內(nèi)給予報道。

［1］周業(yè)恒，江守和，魯潤龍，等.懸鈴木無球果育種的研究［J］.園藝學報，1993，20(3):295－298

［2］Zanel，Bargellonitl.Tarnelloegies for microsatellite isolation:a review［J］.Molecular Ecology，2002，11:1 －16

［3］Wolfe A D，Xiang Q Y，Kephart S R.Assessing hybridization in natural populations of Penstemon(Scrophulariaceae)using hyper variable inter－ simple sequence repeat(ISSR)bands［J］.Mol Ecol，1998，7(9):1107 －1125

［4］Lian C L，Zhou Z H，Hogestu T Z.A simple method for developing microsatellite markers using amplified fragments of inter－simple sequence repeat(ISSR) ［J］.J Plant Res，2001，114:381－385

［5］Culley T M，Wolfe A D.Population genetic structure of the cleistogamous plant species Viola pubescens Aiton(Violaceae)，as indicated by all enzymes and ISSR molecular markers［J］.Heredity，2001，86:545 －556

［6］Sankar A A，Moore G A.Evaluation of inter－simple sequence repeat analysis for mapping in Citrus and extension of the genetic linkage map［J］.Theor Appl Genet，2001，102:206 －214

［7］Weisin K，Atkinsion，Gardner R C.Genomic finger printing by microsatellite－ primed PCR:a critical evaluation［J］.PCR Methods Appl，1995，4(5):249－255

［8］Joshi S P，Gupta V S，Aggarwal R K，et al.Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter simple sequence repeat(ISSR)polymorphism in the genus Oryza［J］.Theor Appl Genet，2000，100:1311 －1320

［9］Wu K S，Tanksley S D.Abundance polymorphisms and genetic mapping of microsatellites in rice［J］.Mole Gen Genet，1993，241:2325 －2351

［10］Blairm W，Panaud O，Mccouch S R.Inter－simple sequence repeat(ISSR)amplification for analysis of microsatellite motif frequency and finger printing in rice(Oryza sativa L.) ［J］.Theor Appl Genet，1999，98:780 －792

［11］姚利華，膝元文.EST－SSR標記及其在果樹研究中的應用［J］.果樹學報，2008，25(2):219－224

［12］李 芳，周 龍，胡建芳.新疆野生櫻桃李SSR體系的建立及應用［J］.北方園藝，2010，(13):120－123

［13］曹喜兵，范國強，張延召.泡桐SSR分子標記反應體系的建立［J］.河南農(nóng)業(yè)大學學報，2009，8(4):368－371

［14］常 莉.利福平處理患叢枝病泡桐幼苗的SSR分析［D］.南京:南京林業(yè)大學碩士生論文，2008

［15］張 靜.利用SSR分子標記研究山楊雜種無性系的遺傳多樣性［D］.沈陽:東北林業(yè)大學碩士學位論文，2003

［16］Yamamoto T，Mmum T，Sawamur A，et al.Simple sequence repeats far genetic analysis in pear［J］.Euphytica，2002，124:129 －137

［17］Gianfranceschi L，Seglias A N，Tarchini R，et al.Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple［J］.Theor Apple Genet，2003，107:1315－1320

［18］Liebhard R，Gianfranceschi L，Koller B，et al.Development and characterization of 140 new microsatellites in apple(Malus domestics Borkh)［J］.Mol Breed，2002，10:217－241

［19］趙阿風.馬尾松無性系指紋圖譜構(gòu)建［D］.南京:南京林業(yè)大學碩士學位論文，2005

［20］Tuskan G A，Gunter L E，Yang Z M，et al.Characterization of microsatellites revealed by genomic sequencing of Populus trichocarpa［J］.Canadian Journal of Forest Research，2004，34:85 －93

［21］劉曉麗.核桃SSR反應體系的優(yōu)化及群體遺傳多樣性分析［D］.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文，2007

［22］Fu X X，Shijisen.Identification of seeds of Pinus species by microsatellite markers［J］.Journal of Forestry Research，2005，16(4):281－284

［23］沈永寶.中國栗屬特有種遺傳多樣性及木本植物種和品種DNA分子鑒定研究［D］.南京:南京林業(yè)大學博士論文，2002

［24］Aranza M.J，Garcia － mas J，Carbo J.Development and variability analysis of microsatellite markers in peach ［J］.Plant Breeding，2002，121:87－92

［25］Dirlewanger E，Cosson P，Tavaud M，et al.Development of microsatellite markers in peach(Prunus persica L.)Batsch and their use in genetic diversity analysis in peach and sweet cherry(Prunus avium L.) ［J］.Theor Appl Genet，2002，105:127 －138

［26］梁海永，劉彩霞，劉興菊.楊樹品種的SSR分析及鑒［J］.河北農(nóng)業(yè)大學學報，2005，28，(4):27－31

［27］Saghali M A，Biyashev R M，Yang G P，et al.Extraordinarily polymorphic microsatellite DNA in barley Species diversity，chromosomal locations，and population dynamics［J］.Proc Natl Acad Scf，1994，91:5466 －5470

［28］艾呈祥，余賢美，張力思.中國部分板栗品種的SSR標記［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2007，15(2):283－289

［29］Szewc－mcfadden A K，Kresovich Sbliek S M，et al.Identification of polymorphic，conserved simple sequence repeats(SSRs)in cultivated Brassica species［J］.Theor.Appl.Genet，1996，93(4):534 －538