苗延虹

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)院，山東泰安 271000)

1 前言

環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)是喹諾酮類藥物中的第三代產(chǎn)品——氟喹諾酮類藥物。別名丙氟哌酸，悉復(fù)欣、環(huán)丙氟哌酸，結(jié)構(gòu)見下圖:

環(huán)丙沙星具備廣譜抗菌活性，殺菌效果好，具有高效、低毒以及口服吸收完全、體內(nèi)分布廣、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，是目前最佳的抗感染藥物之一。除用于人醫(yī)臨床外，已進(jìn)入獸用領(lǐng)域。主要用來預(yù)防和治療動物疾?。?，2］，廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中。因此建立可靠、靈敏、簡便、快速的測定方法對于研究環(huán)丙沙星的藥理，臨床醫(yī)學(xué)和生物殘留具有重要的實(shí)際意義。

有關(guān)環(huán)丙沙星的分析方法，文獻(xiàn)報道的有高效液相色譜法［3，4］、分光光度法［5］、原子吸收光譜法［6］和電分析方法［7，8］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［9，10］、熒光光譜分析法［11－14］等。其中熒光分析法是一種靈敏度高、選擇性好、簡便快速的分子發(fā)射光譜分析法。

圖1 環(huán)丙沙星結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of Ciprofloxacin

本文利用熒光光譜和吸收光譜研究了Eu3+、CIP與SDS的相互作用。環(huán)丙沙星是Eu3+的理想配體，所生成的二元配合物通過分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移，使Eu3+激發(fā)，并發(fā)射其位于615 nm的特征熒光，具有熒光量子產(chǎn)率高、Stokes位移大、發(fā)射峰窄以及熒光壽命長的優(yōu)點(diǎn)。加入陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)后，銪離子位于615 nm處的特征熒光能夠被顯著增強(qiáng)。據(jù)此，本文以Eu3+作為熒光探針，建立了一種測量環(huán)丙沙星的新方法。該方法靈敏度高、選擇性好、干擾少、操作簡單，用于實(shí)際樣品的測定，結(jié)果令人滿意。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

2.1.1 儀器 UV－240型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國VARIAN公司)，pHS－3精密酸度計(jì)(上海自動化儀表有限公司)。

2.1.2 試劑 針劑乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H2004598，0.2 g*100 mL/瓶，樣品1);鹽酸環(huán)丙沙星片劑(萊陽市江波制藥有限責(zé)任公司250 mg∕片，按環(huán)丙沙星計(jì)，樣品2);

氧化銪Eu2O3(99.99%，上海晶純試劑有限公司);β－環(huán)糊精(上海晶純試劑有限公司，99%);分析純;十六烷基三甲基溴化銨CATB(天津市巴斯夫化工有限公司，分析純);曲拉通X－114;十二烷基硫酸鈉(SDS，天津市巴斯夫化工有限公司):準(zhǔn)確稱取一定量SDS，溶于水得濃度為7.299×10－2mol·dm－3的儲備液。使用前以石英亞沸蒸餾水稀釋即得7.299×10－4mol·dm－3的工作液;環(huán)丙沙星儲備液(中國藥品生物制品檢定所):準(zhǔn)確稱取一定量環(huán)丙沙星，以石英亞沸蒸餾水溶解定容得2.460×10－2mol·dm－3的儲備液。使用時以石英亞沸蒸餾水逐級稀釋即得工作液(2.460×10－4mol·dm－3);Eu3+儲備液:準(zhǔn)確稱取2.3280 g Eu2O3(99.99%)，加入少量濃鹽酸，再加入少量過氧化氫，緩慢加熱使其溶解，并揮發(fā)近至干，然后用0.1 mol·dm－3的稀鹽酸稀釋至100 mL，作為儲備液，使用時以石英亞沸蒸餾水稀釋即得工作液(6.615 ×10－3mol·dm－3);0.01 mol·dm－3Tris－HCl緩沖溶液，pH=8.02。

以上儲備液與工作液均需置于0～4℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)保存。所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為石英亞沸二次蒸餾水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

于 10 mL比色管中依次加入1 mL pH=8.02 的 Tris– HCl(0.01 mol·dm－3)緩沖溶液、1.0 mL 2.460 ×10－4mol·dm－3環(huán)丙沙星、1.0 mL 7.299 ×10－4mol·dm－3SDS 和 1.0 mL 6.615 ×10－3mol·dm－3Eu3+，再用石英亞沸蒸餾水定容至刻度10.0 mL，振蕩搖勻，放置40 min，記錄其熒光光譜。在λex/λem=265 nm/615 nm，(激發(fā)和發(fā)射通帶均為5 nm)處，用1 cm石英熒光液池，測定溶液的相對熒光強(qiáng)度F，同時測定試劑空白F0。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光光譜與吸收光譜

按照實(shí)驗(yàn)方法，繪制Eu3+、CIP、CIP－Eu3+和CIP－Eu3+－SDS的發(fā)射光譜(見圖2)。

由曲線1可以看出，單獨(dú)的Eu3+水溶液不能檢測到Eu3+的特征光譜。比較曲線3和曲線4可看出，當(dāng)在Eu3+溶液中加入CIP后，CIP在429 nm處的發(fā)射強(qiáng)度明顯降低，并出現(xiàn)595 nm和615 nm較強(qiáng)的Eu3+的特征熒光峰，分別對應(yīng)于Eu3+的5D0→7F1，5D0→7F2的躍遷。說明CIP和Eu3+生成二元配合物，通過分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移過程，使Eu3+激發(fā)，并發(fā)射銪離子強(qiáng)的特征熒光，曲線2由于表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的加入，改善了Eu3+與CIP的配位微環(huán)境，減少了水分子與絡(luò)合物的結(jié)合，使體系的熒光強(qiáng)度大約增強(qiáng)3倍。

CIP、CIP－Eu3+、CIP－Eu3+－SDS的吸收光譜見圖3，比較曲線1和曲線2，發(fā)現(xiàn)在CIP中加入Eu3+后，吸光度降低，發(fā)生紅移，說明生成二元配合物。比較曲線2和曲線3，發(fā)現(xiàn)在CIP－Eu3+體系中加入SDS后，峰位未變，吸光度增強(qiáng)，這是由于膠束的保護(hù)作用，減少了發(fā)光離子激發(fā)態(tài)無輻射去活造成的能量損失，使體系的熒光量子產(chǎn)率提高，熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)。

3.2 影響體系熒光強(qiáng)度的因素

3.2.1 體系酸度對熒光強(qiáng)度的影響 CIP分子中含有3－羧基－4－氧喹諾酮環(huán)系，7位有一個哌嗪取代基(圖1)，分子中的N原子與O原子在不同酸堿度溶液中的質(zhì)子化程度將直接影響發(fā)光體系電子的性質(zhì)以及電子云分布［15］。因此溶液的pH值會對體系的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生較大的影響。

在 pH值7.26～8.42的范圍內(nèi)測定了CIP－Eu3+－SDS體系的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖4。如圖所示，pH=8.02時，體系的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，說明在此酸度下有利于形成穩(wěn)定的發(fā)光配合物。固定pH值為8.02，實(shí)驗(yàn)了(CH2)6N4－HCl、NH4Cl－NH3、Tris－HCl、NH4A c－HAc四種不同的緩沖溶液對體系熒光強(qiáng)度產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，在Tris－HCl體系中Eu3+敏化熒光強(qiáng)度最大且穩(wěn)定，因此選擇濃度為0.01 mol·dm－3pH=8.02的Tris–HCl緩沖溶液做進(jìn)一步的研究。

圖4 緩沖溶液酸度對熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 The influence of pH on F

3.2.2 緩沖溶液用量對 CIP－Eu3+－SDS體系熒光強(qiáng)度的影響 在pH=8.02條件下，探討了緩沖溶液的用量對體系熒光強(qiáng)度的影響，如下圖所示:

由圖5可知，Tris－HCl緩沖溶液的加入量為0.5～2.0 mL時，熒光強(qiáng)度最大且基本穩(wěn)定，故本文選擇加入1.0 mLTris–HCl緩沖溶液(0.01 mol·dm－3)做進(jìn)一步的研究。

3.2.3 加入順序?qū)w系熒光強(qiáng)度的影響 在同樣的濃度條件下 ，按緩沖溶液、環(huán)丙沙星、Eu3+、SDS的順序加入時，體系的熒光強(qiáng)度F最大，加入穩(wěn)定性也更好 ，穩(wěn)定時間更長。說明這個加入順序最有利于配合物的生成，故本文選擇上述加入順序。

3.2.4 表面活性劑的種類及用量的影響 實(shí)驗(yàn)了不同的表面活性劑Triton X－114、β－環(huán)糊精、SDS、CATB對體系的增敏作用。其中，Triton X－114、β－環(huán)糊精、CATB對體系無增敏作用，只有SDS的增敏效果最好。分析原因主要是稀土離子絡(luò)合物帶正電荷，而SDS是陰離子表面活性劑，帶有負(fù)電荷，兩者更容易結(jié)合。SDS的濃度為7.299×10－5mo l·dm－3時，其用量為1.0 mL最佳。如圖所示:

3.2.5 環(huán)丙沙星和Eu3+濃度的影響 環(huán)丙沙星和Eu3+的濃度對CIP－Eu3+－SDS體系熒光強(qiáng)度(F)的影響見圖7。由圖7可知，CEu3+:CCIP在10～40的范圍內(nèi)時，體系的熒光強(qiáng)度穩(wěn)定且熒光強(qiáng)度F最大。故本文選擇 CEu3+:CCIP=27:1(即濃度為 2.460 ×10－4mol·dm－3的環(huán)丙沙星 1.0 mL，濃度為 6.615 ×10－3mol·dm－3的 Eu3+1.0 mL)進(jìn)行下一步研究。

圖7 環(huán)丙沙星和Eu3+的濃度對體系F的影響Fig.7 Effect of CIP concentration and Eu3+concentration on F

3.2.6 反應(yīng)時間對體系熒光強(qiáng)度的影響 反應(yīng)時間對體系的熒光值有較大的影響，由圖8可知體系在40 min后熒光值基本達(dá)到穩(wěn)定，故本文選擇40 min后開始測定。

圖8 反應(yīng)時間對體系的熒光強(qiáng)度的影響Fig.8 Effect of reaction time on the fluorescence intensity of system

3.2.7 測定CIP的線性范圍與檢出限 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，繪制了CIP校準(zhǔn)曲線，在CIP－Eu3+－SDS體系中，CIP的濃度變化與體系在λex/λem=265 nm/615 nm處的F，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程 Y=－59.32+9.710X，相關(guān)系數(shù) r=0.9965，方法的線性范圍 2.46 ×10－7mo l·dm－3～ 9.84 ×10－5mo l·dm－3，檢出限為1.92 ×10－7mol·dm－3。

3.3 樣品中 CIP的測定

取1支針劑用石英亞沸二次蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，另取2片藥片，加入20% 的三氯乙酸，溶解，抽濾，濾液用石英亞沸二次蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，再分別逐級稀釋至測定CIP的線性范圍之內(nèi)。測定結(jié)果見下表。

樣品中CIP的測定Table Determination of CIP in injection and tablet samples(n=3)

由上表可以看出本方法對測定CIP含量有較好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

4 體系CIP－Eu3+－SDS熒光增強(qiáng)機(jī)理的探討

環(huán)丙沙星含有A－酮酸結(jié)構(gòu)，是銪離子的理想配體，而且可以通過分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移敏化銪的特征熒光。加入陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)后，進(jìn)一步增強(qiáng)了體系的熒光強(qiáng)度。

從圖2可以看出，在CIP體系中加入Eu3+后，CIP在429 nm處的發(fā)射強(qiáng)度明顯降低，并出現(xiàn)595 nm和615 nm較強(qiáng)的Eu3+的特征熒光峰，說明發(fā)生了分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移，生成了CIP－Eu3+二元配合物。加入SDS后，生成三元配合物，更有利于能量轉(zhuǎn)移。從圖3也可以看出，CIP－Eu3+－SDS體系的吸收光譜與CIP－Eu3+體系的非常相似，但強(qiáng)度增大了。也說明生成了CIP－Eu3+－SDS三元絡(luò)合物。

Eu3+是6～8個配位數(shù)的稀土離子，實(shí)驗(yàn)中Eu3+與CIP濃度比為27∶1，是不飽和配位，在水溶液中，CIP－Eu3+易與水分子配位形成CIP－Eu3+－(OH2)n配位結(jié)構(gòu)。

CIP－Eu3+－(OH2)n配合物中的Eu3+有多余的正電荷，很容易與SDS上的十二烷基磺酸根負(fù)離子通過靜電作用相互結(jié)合，另外，SDS上的十二烷基磺酸根負(fù)離子中的 O還可取代 (OH2)n與Eu3+配位生成具有緊密結(jié)構(gòu)的三元配合物，伴隨著放出CIP－Eu3+－(OH2)n配合物中的H2O，從而降低了水分子中O—H鍵振動引起的非輻射能量損失。因此，SDS的加入，減少分子內(nèi)活化過程及熒光猝滅效應(yīng)，使得熒光增強(qiáng)。

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