張承英，張建榮，耿燕秋，丁 韜

抗Thy1 腎炎模型是模擬人類腎小球疾病建立的以抗Thy1 抗原單克隆抗體誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性系膜增殖性腎小球腎炎動(dòng)物模型。來(lái)氟米特是一種新型的免疫抑制藥，其活性代謝產(chǎn)物A771726 可選擇性地抑制二氫乳清酸脫氫酶(DHOPH)的活性，阻斷嘧啶的從頭合成，發(fā)揮抗增殖作用［1］。來(lái)氟米特還可以抑制各種炎性反應(yīng)刺激誘導(dǎo)的NF－κB 的活化，下調(diào)NF－κB 調(diào)控基因的表達(dá)，發(fā)揮抗炎和抑制免疫的作用［2］。本研究擬以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥鹽酸苯那普利為對(duì)照，觀察來(lái)氟米特及來(lái)氟米特聯(lián)合苯那普利對(duì)慢性實(shí)驗(yàn)性系膜增殖性腎炎的療效。

1 材料與方法

1.1 OX7 抗體的制備與鑒定

1.1.1 OX7 抗體的制備 復(fù)蘇OX7 雜交瘤細(xì)胞，由解放軍總醫(yī)院全軍腎臟病研究所提供，用10%的1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)生長(zhǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到107/ml，pH值7.0 左右，1 ∶2 ～4 傳代(傳代后細(xì)胞密度達(dá)到105/ml)，加入10 ml 10%的1640 培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h(細(xì)胞上清液變?yōu)辄S色，細(xì)胞密度達(dá)到107/ml，pH 7.0)，收集細(xì)胞上清，用minipore 離心柱離心(4℃，3000 r/min，30 ～45 min)，濃縮10 ～15 倍，收集濃縮液，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，－70 ℃凍存。

1.1.2 OX7 抗體的鑒定 用正常大鼠冷凍切片，采用間接免疫熒光法對(duì)OX7 抗體進(jìn)行鑒定。

1.2 動(dòng)物模型的制備

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar 大鼠60 只(清潔級(jí))，體重150 ～200 g，由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并喂養(yǎng)。動(dòng)物室保持12 h 晝夜循環(huán)，室溫控制在19 ～29℃，濕度40% ～70%，動(dòng)物自由攝取水和食物。

1.2.2 動(dòng)物模型的制備 60 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行單側(cè)腎切除。單側(cè)腎切除后將大鼠隨機(jī)分為5 組:單純腎切組、模型對(duì)照組、來(lái)氟米特治療組、苯那普利治療組及來(lái)氟米特聯(lián)合苯那普利治療組(聯(lián)合治療組)，每組12 只。除單純腎切組外，其余各組在單側(cè)腎切除后3 d 尾靜脈注射OX7 抗體(100 mg/kg)，1 周后尾靜脈連續(xù)注射OX7 抗體(每次100 mg/kg，1 次/周，共3 次)，單純腎切除組在同一時(shí)間尾靜脈注射PBS，注射抗體后第2 天分組給予來(lái)氟米特、苯那普利及來(lái)氟米特聯(lián)合苯那普利治療，單純腎切組、模型對(duì)照組給予相應(yīng)量的蒸餾水。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察各組大鼠的一般情況、體重、尿蛋白、血肌酐。各組大鼠每周稱一次體重，按體重調(diào)整給藥和蒸餾水量。分別于給藥前(即0 周)、給藥后4 周末、8 周末、12 周末收集、記錄24 h 尿量，用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)尿蛋白濃度，計(jì)算24 h 尿蛋白定量。各組大鼠于給藥前及處死動(dòng)物前采血，檢測(cè)血清肌酐(Scr)水平。

給藥4、8 周后分別處死3 只大鼠行腎臟病理檢查。10%甲醛固定的腎組織經(jīng)過(guò)常規(guī)處理后，石蠟包埋，用2μm 的石蠟切片，進(jìn)行PAS 染色，由病理醫(yī)師參照文獻(xiàn)［3］方法，在光鏡下進(jìn)行半定量積分。腎小球的硬化程度積分:0 分(正常腎小球);1 分(系膜區(qū)擴(kuò)張或硬化面積＜25%);2 分(硬化面積25% ～＜50%);3 分(硬化面積50% ～＜75%);4分(硬化面積≥75%)。每個(gè)標(biāo)本在400 倍光鏡下連續(xù)觀察50 個(gè)不同的腎小球，求平均數(shù)作為腎小球硬化指數(shù)。小管間質(zhì)積分:根據(jù)病變(腎小管萎縮、管型、間質(zhì)炎性反應(yīng)和纖維化)范圍，分別給0 ～3分(0 分，無(wú)小管間質(zhì)損害;1 分，輕度＜25%;2 分，中度25% ～＜50%;3 分，重度≥50% )，100 倍光鏡下，每個(gè)標(biāo)本觀察10 個(gè)皮質(zhì)視野，求平均數(shù)作為腎小管間質(zhì)病變指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS12.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)采用±s 表示，不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠體重、尿蛋白、血肌酐的比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析;同一時(shí)間點(diǎn)不同組之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 單純腎切組大鼠表現(xiàn)機(jī)警，反應(yīng)快，皮毛致密、整齊而有光澤，生長(zhǎng)、進(jìn)食及活動(dòng)均無(wú)明顯異常，體重逐漸增加，無(wú)死亡。聯(lián)合治療組在8周死亡2 只。來(lái)氟米特及苯那普利治療組在10 周分別死亡1 只，其余各組大鼠無(wú)死亡。手術(shù)時(shí)各組大鼠的體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療4、8、12 周時(shí)模型對(duì)照組及治療各組大鼠的體重均明顯低于單純腎切組，治療各組大鼠體重與模型對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。

2.2 間接免疫熒光 OX7 抗體在腎小球系膜區(qū)呈顆粒樣沉積。

2.3 尿蛋白和血肌酐 手術(shù)前各組大鼠24 h 尿蛋白量和血肌酐均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。單純腎切組兩個(gè)指標(biāo)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，均無(wú)明顯變化(P ＞0.05)。模型組及各治療組兩個(gè)指標(biāo)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加(P＜0.05)。治療4 周時(shí)，治療各組與模型組比較，兩個(gè)指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。治療8 周及12周時(shí)，治療各組與模型組比較，兩個(gè)指標(biāo)均顯著降低(P ＜0.05)，聯(lián)合治療組比單獨(dú)用藥組降低程度更為顯著(P ＜0.05，表1)。

表1 不同藥物對(duì)慢性抗thy1 腎炎大鼠體重、尿蛋白及血肌酐的變化(±s)

表1 不同藥物對(duì)慢性抗thy1 腎炎大鼠體重、尿蛋白及血肌酐的變化(±s)

注:各組大鼠體重、尿蛋白量及血肌酐水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加(P ＜0.05);同一時(shí)間點(diǎn)，與單純腎切組比較，①P ＜0.05;與模型組比較，②P ＜0.05;與來(lái)氟米特組比較，③P ＜0.05;與苯那普利組比較，④P ＜0.05

項(xiàng)目組別0周4周8周12周n 測(cè)量值體重(g)單純腎切組12 153.20±4.21 12 398.10±12.34 9598.67±34.1測(cè)量值n 測(cè)量值n 測(cè)量值n 26624.56±28.26模型對(duì)照組12 151.54±6.35 12 322.35±16.23①9485.68±24.33①6567.21±21.45①來(lái)氟米特組12 159.22±8.15 12 289.22±21.25①9453.12±22.14①5528.57±18.22①苯那普利組12 162.11±6.34 12 293.26±15.29①9464.39±18.37①5517.37±15.33①聯(lián)合治療組12 154.39±7.66 12 266.87±11.36①7439.45±14.66①4523.39±12.55①24 h 尿單純腎切組127.73±1.21 129.37±1.74912.36±2.52613.31±2.12蛋白(mg)模型對(duì)照組126.52±0.64 1248.29±14.27①988.36±21.37①6154.38±37.22①來(lái)氟米特組126.02±1.25 1239.26±11.02①963.12±10.35①②596.67±24.46①②苯那普利組128.33±1.07 1245.23±15.17①951.33±9.56①②③ 577.31±19.58①②③聯(lián)合治療組126.38±1.28 1242.11±12.55①734.59±11.27①②③④455.59±21.37①②③④血肌酐單純腎切組1233.23±5.45 1238.89±6.41940.87±5.21645.34±7.48(μmol/L)模型對(duì)照組1236.12±3.46 1255.76±8.17① 987.35±15.43①698.15±17.23①來(lái)氟米特組1234.25±5.43 1253.28±9.42① 967.23±13.14①②582.15±21.26①②苯那普利組1237.95±4.34 1250.77±11.16①969.73±9.34①②576.38±17.23①②聯(lián)合治療組1235.26±6.12 1251.76±8.53① 752.79±10.61①②③④463.89±12.18①②③④

2.4 腎臟病理 單純腎切組大鼠腎小球代償性肥大，毛細(xì)血管袢輕度擴(kuò)張，腎小管及間質(zhì)無(wú)明顯改變，排列分布及形態(tài)均正常。第4 周，模型組大鼠腎小球系膜細(xì)胞輕度增生，系膜基質(zhì)增多;第8 周，腎小球系膜細(xì)胞明顯增生，系膜基質(zhì)增多，毛細(xì)血管或擴(kuò)張或閉塞，腎小球囊壁增厚;第12 周可見(jiàn)部分腎小球節(jié)段性或球性硬化，腎小管擴(kuò)張或萎縮，可見(jiàn)大量蛋白管形，腎間質(zhì)增寬，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。各治療組病變較模型組明顯減輕(P ＜0.05，表2)。見(jiàn)圖1、2。

表2 不同藥物作用下慢性抗thy1 腎炎第12 周大鼠腎臟病理積分(±s)

表2 不同藥物作用下慢性抗thy1 腎炎第12 周大鼠腎臟病理積分(±s)

注:與單純腎切組比較，①P ＜0.05;與模型組比較，②P ＜0.05;與來(lái)氟米特組比較，③P ＜0.05;與苯那普利組比較，④P ＜0.05

組別n 腎小球積分腎小管間質(zhì)積分單純腎切組60.16 ±0.130.23 ±0.12模型對(duì)照組61.69 ±0.27①1.88 ±0.32①來(lái)氟米特組51.11 ±0.31①②1.25 ±0.24①②苯那普利組51.07 ±0.19①②1.16 ±0.21①②聯(lián)合治療組40.76 ±0.22①②③④ 0.83 ±0.14①②③④

3 討論

大鼠胸腺細(xì)胞膜同腎小球系膜細(xì)胞膜上存在共同的表面抗原Thyl，利用抗Thyl 抗體誘導(dǎo)抗原‐抗體反應(yīng)，形成大分子原位免疫復(fù)合物，沉積于腎小球系膜區(qū)可引起系膜細(xì)胞增殖、系膜基質(zhì)增多等典型表現(xiàn)，該模型是一種急性、自限性的系膜增生性腎炎模型［4］。采用對(duì)單側(cè)腎切除大鼠重復(fù)注射抗Thyl抗體的方法，可以誘導(dǎo)不可逆的腎損傷，建立慢性系膜增生性腎炎大鼠模型［5］。OX7 雜交瘤細(xì)胞可穩(wěn)定分泌抗Thyl 抗體，抗Thyl 系膜增生性腎炎大鼠模型是一種經(jīng)典的系膜增生性腎炎大鼠模型，由于其疾病過(guò)程與人類IgA 腎病及其他的系膜增生性腎炎的疾病進(jìn)程相似，故可以模擬人類的系膜增生性腎炎，用來(lái)研究慢性腎臟病的發(fā)病機(jī)制以及新的治療策略。

蛋白尿是腎小球損傷的一個(gè)標(biāo)志，也是慢性腎臟疾病進(jìn)展的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，降低蛋白尿可以延緩疾病的進(jìn)展。既往的研究表明血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥苯那普利能有效抑制AngⅡ產(chǎn)生，使血壓下降同時(shí)優(yōu)先擴(kuò)張腎血管后括約肌，使出球小動(dòng)脈阻力降低，腎小球后負(fù)荷減輕，從而降低腎小球內(nèi)壓力，降低腎臟高濾過(guò)、高灌注性損害，達(dá)到保護(hù)腎功能的目的。此外血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥還可以降低腎小球基底膜的通透性，保護(hù)腎小球足細(xì)胞，減少腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的蓄積，從而降低蛋白尿，延緩腎衰竭的進(jìn)展［6，7］。

來(lái)氟米特是一種新型的人工合成的異惡唑類藥物，由于具有免疫抑制和抗增殖作用，已廣泛用于治療多種自身免疫性疾病和免疫介導(dǎo)性疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、狼瘡性腎炎及器官移植排異反應(yīng)。Ogawa 等［8］用來(lái)氟米特治療大鼠抗基底膜腎小球腎炎，結(jié)果顯示來(lái)氟米特能夠顯著減少尿蛋白、血漿膽固醇及纖維蛋白原，明顯改善毛細(xì)血管壁IgG 和C3 的沉積。何偉春等［9］用來(lái)氟米特治療大鼠阿霉素腎病模型，發(fā)現(xiàn)來(lái)氟米特可以減少大鼠阿霉素腎病模型尿蛋白的排泄量。

為了觀察來(lái)氟米特對(duì)慢性系膜增生性腎炎大鼠模型的療效，筆者以苯那普利為對(duì)照，對(duì)慢性系膜增生性腎炎大鼠模型加用來(lái)氟米特治療，發(fā)現(xiàn)與模型對(duì)照組相比，來(lái)氟米特治療可以明顯降低模型大鼠的蛋白尿及血肌酐水平(P ＜0.05)，其作用與苯那普利對(duì)照組相似。而來(lái)氟米特聯(lián)合苯那普利對(duì)慢性系膜增生性腎炎大鼠模型的作用，與單獨(dú)使用來(lái)氟米特或苯那普利組相比，其尿蛋白和血肌酐水平以及腎小球及間質(zhì)小管病理積分更低(P ＜0.05)，提示聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果更好。

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