山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司 廉新慧 谷 巍 劉鳳芝

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，生物活性多糖可參與各種生命活動(dòng)調(diào)節(jié)，激活免疫細(xì)胞，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤，提高機(jī)體免疫力等作用。因此，研制生物活性多糖免疫調(diào)節(jié)劑是生物醫(yī)藥發(fā)展的重要方面之一。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種 產(chǎn)朊假絲酵母、蛹蟲草、靈芝，均由寶來(lái)利來(lái)生物研究院提供。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)純昆明種小鼠，體重（18±2）g，購(gòu)自泰邦生物工程有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，瓊脂1.6%，水，自然pH。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基：不加瓊脂，其余同斜面培養(yǎng)基。

1.2.2 酵母菌的發(fā)酵培養(yǎng) 取出于4℃保藏的菌種，接于斜面培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng) 48 h，進(jìn)行活化。將已活化的菌種，接于已裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中于30℃、180 r／min搖床培養(yǎng)48 h，進(jìn)行種子的擴(kuò)大。將培養(yǎng)液離心，收集菌泥，干燥，稱重，計(jì)算生物量。

1.2.3 酵母胞壁多糖的提取 酵母溶解，凍融，超聲波破碎（吳小剛等，2006）。

1.2.4 蛹蟲草和靈芝的培養(yǎng) 培養(yǎng)方法同酵母菌，培養(yǎng)基為土豆20%，葡萄糖2%，磷酸氫二鉀0.3%，硫酸鎂0.15%，維生素B15～10 mg/L，pH 6.0，蟲草 25℃、靈芝 28℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液待用。

1.2.5 黃芪多糖的制備 用水煎法生產(chǎn)制備 （王志俊，2010）。

1.2.6 多糖含量的測(cè)定 對(duì)酵母菌破壁后的懸濁液、蛹蟲草菌絲體的培養(yǎng)物、靈芝菌絲體的培養(yǎng)物、黃芪水煎液用苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量（張青和張?zhí)烀瘢?004）。

1.2.7 動(dòng)物分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為4組，每組40只，雌雄各半。4種多糖等量復(fù)配，分為3個(gè)劑量組，Ⅰ組：低劑量組（35 mg多糖/kg體重），Ⅱ組：中劑量組（70 mg多糖/kg體重），Ⅲ組：高劑量組（140 mg多糖/kg體重），對(duì)照組灌胃生理鹽水（龔曉健，2000）。根據(jù)體重按設(shè)定的劑量每天定時(shí)灌胃1次，自由采食，飲水（楊鐵虹等，2005）。試驗(yàn)期為30 d。

1.2.8 小鼠生長(zhǎng)狀況及增重率 觀察體毛、神志、飲食及活動(dòng)情況。試驗(yàn)期每隔10 d測(cè)一次小鼠體重。

1.2.9 免疫指標(biāo)測(cè)定

1.2.9.1 免疫器官指數(shù)的測(cè)定 分別在試驗(yàn)開始后11、21、31 d，稱重后處死小鼠，取出胸腺和脾臟分別稱濕重，然后計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)。胸腺或脾臟指數(shù)=胸腺重或脾重/體重。

1.2.9.2 巨噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定 分別于試驗(yàn)開始第11、21、31天飼喂后1 h，每只小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液0.5 mL，8～12 h后處死，取腹腔液涂片，37℃溫孵30 min，漂洗，晾干。用姬-瑞氏混合液染色，并計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

吞噬百分率/%=（吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞）×100；

吞噬指數(shù)/%=（被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞）×100。

1.2.9.3 外周血液免疫球蛋白IgG含量的測(cè)定分別在試驗(yàn)開始后11、21、31 d，小鼠眼球采血1 mL，收集血清，采用小鼠 IgG酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒測(cè)定。

1.2.10 小鼠抗應(yīng)激能力的測(cè)定

1.2.1 0.1 對(duì)小鼠常壓耐缺氧的影響 雌、雄小鼠各5只，于末次給藥30 min后，將小鼠放入存有鈉石灰的密閉容器內(nèi)，立即計(jì)時(shí)，以呼吸停止為死亡時(shí)間。

1.2.1 0.2 對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響 雌、雄小鼠各5只，于末次給藥30min后，將每只小鼠負(fù)重0.05g/g，置于20℃的水箱內(nèi)，水深20 cm，計(jì)時(shí)至小鼠沉入水中的時(shí)間為游泳時(shí)間。

1.2.1 0.3 對(duì)小鼠耐高溫能力的影響 雌、雄小鼠各5只，于末次給藥30 min后，將小鼠置于46～50℃的烘箱內(nèi)，觀察并記錄小鼠的存活時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 多糖含量測(cè)定結(jié)果 由表1可見，黃芪的多糖含量最高，其次是蟲草菌絲體多糖，酵母胞壁多糖和靈芝菌絲體多糖含量最低。

表1 多糖含量測(cè)定結(jié)果 mg/mL

3.2 小鼠生長(zhǎng)狀況和增重率變化 各組小鼠在實(shí)驗(yàn)前后進(jìn)食量、進(jìn)水量正常，被毛光澤、活動(dòng)良好，反應(yīng)敏捷，說(shuō)明不同劑量復(fù)合多糖對(duì)小鼠生長(zhǎng)狀況無(wú)不良影響。增重率變化見表2。

表2 小鼠增重率的變化 %

由表2可知，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組增重率顯著提高（P＜0.05）。在31 d時(shí)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ劑量組分別顯著提高4.13%、11.19%、26.19%。

3.3 小鼠免疫指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

3.3.1 小鼠免疫器官指數(shù)的變化 由表3可知，對(duì)胸腺指數(shù)的影響，與對(duì)照組相比，Ⅰ組在21、31 d較對(duì)照組，分別提高9.82%和11.15%（P＜0.05）；Ⅱ組在11、21、31 d時(shí)較對(duì)照組分別提高9.27%、19.64%、20.77%（P ＜ 0.05）； Ⅲ組在 11、21 d和31 d時(shí)較對(duì)照組分別提高11.22%、29.02%、23.85%（P ＜ 0.05）。

表3 小鼠免疫器官指數(shù)的變化 mg/g

對(duì)脾臟指數(shù)的影響，與對(duì)照組相比較，Ⅰ組沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）；Ⅱ組在21 d時(shí)較對(duì)照組提高5.6%（P＜0.05）（P＞0.05）； Ⅲ組在21 d和31 d較對(duì)照組分別提高9.26%和10.13%（P＜0.05）。

3.3.2 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的變化 由表4可知，對(duì)吞噬百分率的影響，各試驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），在31 d時(shí)，分別較對(duì)照組提高26.05%、55.23%、72.47%。對(duì)吞噬指數(shù)的影響，各試驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），在31 d時(shí)，分別較對(duì)照組提高11.36%、26.67%、40.32%。

表4 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的變化%

3.3.3 小鼠外周血液免疫球蛋白IgG含量的變化由表5可知，對(duì)IgG含量的影響，與對(duì)照組相比，Ⅰ組未產(chǎn)生顯著變化（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，Ⅱ組在11d時(shí)顯著提高9.06%（P＜0.05）；Ⅲ組在11、21、31 d時(shí)分別顯著提高9.90%、12.28%、10.92%（P ＜ 0.05）。

表5 小鼠IgG含量的變化 μg/mL

3.4 復(fù)合多糖對(duì)小鼠抗應(yīng)激能力的影響 由表6可知，各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，小鼠的常壓耐缺氧時(shí)間，游泳時(shí)間，耐高溫時(shí)間均顯著延長(zhǎng) （P＜0.05）。

表6 多糖對(duì)小鼠抗應(yīng)激作用的影響min

4 討論

4.1 對(duì)小鼠生存狀況及體增重的影響 多糖能夠明顯加快動(dòng)物的生長(zhǎng)，提高動(dòng)物體增重，其機(jī)制是，當(dāng)多糖提高動(dòng)物的免疫功能之后，必然會(huì)增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)外來(lái)病原的抵抗作用，從而促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)。有研究表明，在飼料中添加冬蟲夏草能提高機(jī)體免疫功能，促進(jìn)雞生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率，節(jié)約單位增重的耗料量 （劉正遠(yuǎn)等，2006；魏建忠，2005）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，三組復(fù)合多糖均能顯著提高小鼠的增重率。

4.2 對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響 胸腺和脾臟是動(dòng)物的重要免疫器官。免疫器官的重量在一定程度上可反映免疫器官內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，當(dāng)動(dòng)物處于應(yīng)激反應(yīng)衰竭期時(shí)，胸腺、脾臟及體重也相應(yīng)降低，因此測(cè)定動(dòng)物體重、胸腺及脾臟重量指數(shù)可反映機(jī)體免疫能力。本試驗(yàn)結(jié)果可見，各試驗(yàn)組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有所增加，中、高劑量組，增加明顯。 這與姚慶志等（2011）的試驗(yàn)結(jié)果一致。

4.3 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 巨噬細(xì)胞是一種典型的炎癥細(xì)胞，對(duì)激活劑有很高的敏感性，在微量激活劑的作用下，巨噬細(xì)胞體積可增大，吞噬活力增強(qiáng)。因此，吞噬細(xì)胞吞噬活性大小在一定程度上反映了機(jī)體的非特異性免疫功能。利用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的數(shù)量，可在體外觀察巨噬細(xì)胞的吞噬功能。龔曉健等（2000）研究表明，人工蟲草胞內(nèi)及胞外多糖均有增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，不同劑量復(fù)合多糖均能顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)（P＜0.05）。

4.4 對(duì)小鼠IgG含量的影響 抗體是體液免疫的最終產(chǎn)物，IgG是血清中的重要抗體，在體液免疫中起主要作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組IgG含量均明顯提高。

4.5 對(duì)小鼠抗應(yīng)激能力的影響 國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)，應(yīng)激能影響動(dòng)物的免疫機(jī)能。大量研究表明，應(yīng)激后，吞噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)明顯降低，脾臟NK細(xì)胞活性和淋巴細(xì)胞對(duì)ConA刺激的增殖反應(yīng)降低。這種應(yīng)激引起的免疫抑制在一定時(shí)間可恢復(fù)，再次應(yīng)激刺激仍可表現(xiàn)出抑制作用，尤其是對(duì)NK細(xì)胞活性的抑制；同時(shí)，應(yīng)激對(duì)T、B淋巴細(xì)胞功能也存在抑制作用。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，小鼠的常壓耐缺氧時(shí)間，游泳時(shí)間，耐高溫時(shí)間均明顯延長(zhǎng)，這與各試驗(yàn)組對(duì)小鼠的免疫增強(qiáng)作用是一致的。路筱濤和鮑淑娟（2002）試驗(yàn)也證實(shí)，刺梨多糖能明顯延長(zhǎng)小鼠耐缺氧時(shí)間及游泳時(shí)間，還能提高小鼠耐高溫、耐低溫的能力，因此具有明顯的抗應(yīng)激作用。

迄今為止，己有300多種活性多糖從天然產(chǎn)物中被分離提取。但這些被分離提取出的多糖多為植物多糖，由于微生物多糖除具有與植物活性多糖類似的結(jié)構(gòu)、組成成分及生物功能外，還具有生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)不受季節(jié)與地理?xiàng)l件及病蟲害限制、無(wú)毒及不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。把三種免疫效果較好的微生物多糖與黃芪多糖復(fù)配在一起，既節(jié)約成本，又獲得具有多種活性的復(fù)合多糖，從而實(shí)現(xiàn)了多糖間的互補(bǔ)性和協(xié)同性。

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