文 / 任倩然 張 昊 郭慧媛 任發(fā)政 中國農業(yè)大學教育部—北京市共建功能乳品重點實驗室

目前市場上一些高檔乳制品產(chǎn)量較少，供應量變化大，在利益的驅使下導致乳制品中摻假的違法事件時有發(fā)生。為應對這一問題，開發(fā)快速可靠的乳制品摻假的鑒別方法就顯得十分重要。目前，針對乳制品摻假的鑒別方法主要分為免疫學法和非免疫學法[1]。非免疫學法包括高效液相色譜[2]、毛細管電泳[3]和等電聚焦電泳等[4]。盡管這些方法都各有優(yōu)點，但存在工作量大，成本高等問題。相比而言，以免疫學為基礎的方法就顯示出了更多的優(yōu)勢。在過去的幾年里，免疫分析法已成功地應用到了乳制品的定量檢測和摻假鑒別中，酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）因其快速便捷，成本較低的優(yōu)點已成為應用最廣泛的免疫學方法之一。

1 酶聯(lián)免疫法

1.1 反應原理

酶聯(lián)免疫吸附實驗的基本原理是：在固相載體（如聚苯乙烯反應板）上包被抗原或抗體后，通過抗原抗體反應使酶標抗體（或酶標抗原）結合到載體上。經(jīng)洗滌使結合的酶標抗體和游離的酶標抗體分離，洗去游離的酶標抗體（或酶標抗原），加入底物顯色。底物顯色的程度與在實驗中使用的標準物濃度以及被測抗原或抗體的濃度成正比[5]。根據(jù)抗原、抗體的親和力和檢測條件，最低可以檢測到10 pg/mL的抗原或抗體。

1.2 分類

酶聯(lián)免疫法是以固相吸附技術為基礎的，根據(jù)Crowther的分類，可以分為以下4 種：①直接法：抗體或抗原包被于固相載體，直接與酶標記的特異性抗體或抗原結合。②間接法：抗體和包被在固相載體上的抗原發(fā)生特異性反應。通過添加酶標記二抗來檢測標本中相應的抗原或抗體的量。③雙抗體夾心法：其中的直接法，是將特異性抗體（捕獲抗體）包被于固相載體后與抗原進行結合，然后加入針對抗原的酶標記特異性抗體（檢測抗體），加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。其中，捕獲抗體和檢測抗體可以是來源相同的血清也可以是來源不同的血清。這種方法要求欲測的抗原必須有2 個可以與抗體結合的位點。而在間接法中，檢測抗體和捕獲抗體是來自于不同的物種的，而酶標抗體是和特異性檢測抗體而不是捕獲抗體綁定在一起的。④競爭法：也可分為直接和間接競爭法，2 個反應物（抗體或抗原）和包被的抗原或抗體進行反應，2 個反應物（抗體或抗原）作為競爭者同時參與到該反應中[6]。

1.3 抗體

抗體是進行酶聯(lián)免疫法的基礎，主要分為多克隆抗體和單克隆抗體。第一代抗體是多克隆抗體，即利用抗原免疫動物后獲得的抗體；第二代抗體為單克隆抗體，即通過雜交瘤技術制備出針對抗原中某一抗原決定簇的抗體。

1.3.1 多克隆抗體的概念及制備方法

多克隆抗體是指用一種包含多種抗原決定簇的抗原來免疫動物，即可刺激機體多個B細胞克隆產(chǎn)生針對多種抗原表位的不同抗體。制備多克隆抗體首先要進行免疫原的制備，包括天然抗原和人工合成抗原，然后用得到的抗原進行動物免疫。為了獲取高質量的抗體，除了需制備高純度的抗原外，還需選擇適宜的動物和設計有效可行的免疫方案，免疫后要將免疫血清通過親和層析、離子交換層析等方法進行純化，用得到的較純的血清進行效價、特異性、純度及親和力的鑒定。

1.3.2 單克隆抗體的概念及制備方法

單克隆抗體是指由一個識別一種抗原表位的B細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體，均一度高，特異性強，效價高，少或無交叉反應性。單克隆的制備方法首先也要進行免疫，免疫后進行血清效價測定，之后選擇出效價合適的小鼠獲得其B淋巴細胞。而要得到單克隆抗體就需要得到能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細胞。但這種B淋巴細胞不能在體外生長，而實驗發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細胞可在體外生長繁殖，應用細胞雜交技術可將骨髓瘤細胞與上面得到的淋巴細胞二者合二為一，即可得到雜種的骨髓瘤細胞。之后將得到的雜交瘤進行選擇，然后運用ELISA方法對抗體進行初篩。將篩得的專一性雜交瘤細胞用有限稀釋法克隆化，之后向小鼠體內接種該雜交瘤細胞制備腹水或血清，大量制備單抗，最后將抗體進行純化鑒定并保存。

2 多克隆抗體酶聯(lián)免疫法在乳制品摻假檢測中的應用

2.1 抗乳清蛋白多克隆抗體的應用

Garc í a等學者報道了使用針對乳清蛋白的多克隆抗體，采用間接ELISA法，定量檢測綿羊奶中摻假的牛奶。通過免疫兔子制備抗牛奶乳清蛋白的生物素標記多克隆抗體，并利用綿羊和山羊乳白蛋白消除其與綿羊奶和山羊奶的交叉反應。該方法可以檢測到1%～50%的牛奶添加到綿羊奶中。但是，這一方法對于商業(yè)上經(jīng)高溫滅菌的牛奶檢測限較低[7]。此外，他們還將制備出的抗體與凍干的牛乳清蛋白和綿羊乳清蛋白進行混合反應，選出具有特異性的兔抗山羊乳清蛋白的多克隆抗體，以間接ELISA方法檢測，可檢測到1%～100%的山羊奶摻入母羊奶中[8]。Sauer等人利用雙抗夾心法，用羊抗牛IgG的特異性抗體檢測在綿羊奶或山羊奶中摻入的牛奶，得到的抗體與綿羊、山羊的IgG和用辣根過氧化物酶標記的抗體無交叉反應，實驗的檢測限為0.001%[9]。Garc í a等人利用雙抗夾心ELISA法，用兔抗山羊乳清蛋白多克隆抗體定量檢測，可以檢測到在綿羊奶中摻加的0.5%～100.0%山羊奶。但是對于滅菌后的山羊奶檢測結果較低[10]。綜上所述，乳清蛋白的免疫原性較好，但其對加熱很敏感，當熱處理過的牛奶被用來檢測時可能會引起假陰性反應。

2.2 抗酪蛋白多克隆抗體的應用

乳制品的高溫處理有可能改變其中蛋白質的抗原性，而相對于乳清蛋白，酪蛋白在免疫反應中不會受到加熱處理的影響，因此，其更適合在免疫學方法中作為抗原來檢測不同種類的加熱乳制品。許多學者研究開發(fā)出了以針對酪蛋白的多克隆抗體進行ELISA檢測的方法。Rodr í guez等人使用間接ELISA方法可以檢測到綿羊奶中摻入1%～50%的牛奶，在生物素化后，兔抗牛酪蛋白的多克隆抗體與凍干的山羊和綿羊酪蛋白進行混合，可提高其針對牛奶的特異性[11]。

除利用免疫奶中全酪蛋白產(chǎn)生的多克隆抗體進行檢測外，又發(fā)展了利用酪蛋白單體對應的多抗進行乳制品摻假的鑒別，在一定程度上提高了檢測限。如兔抗牛γ3酪蛋白和雞抗牛γ3酪蛋白的多克隆抗體就被Richter等人在間接競爭ELISA法中使用。實驗通過固相吸附含有纖維蛋白溶解酶處理的綿羊酪蛋白來降低天然抗血清的交叉反應，該方法的檢測限為0.1%，并且可特定的在以綿羊和山羊奶為原料的干酪中鑒別牛奶，高溫處理對結果不會產(chǎn)生影響[12]。

2.3 抗乳蛋白多肽段多克隆抗體的應用

對于針對合成多肽的多克隆抗體，相當于定義一段可作為免疫抗原的酪蛋白或乳清蛋白的特異性區(qū)域（即肽段），合成后，以其作為人工抗原進行免疫，產(chǎn)生的抗體被用來檢測在綿羊和山羊奶干酪中的牛奶。Bitri等人就采用了一種競爭ELISA方法，用來檢測牛酪蛋白巨肽（CMP），從而來鑒別綿羊或山羊奶和干酪中是否混入了生的或者經(jīng)過加熱處理的牛奶。他們用化學合成的牛κ酪蛋白139～152肽段做抗原免疫產(chǎn)生兔抗多克隆抗體，純化后的抗原（牛CMP）通過酶標板被固相吸附，然后和一定量的抗體進行特異性反應，可以檢測摻入0.25%～64.00%的牛奶[13]。Rolland等人化學合成了牛αs1酪蛋白的140～149肽段，該肽段比綿羊αs1酪蛋白缺失部分多了2 個氨基酸，并以此肽段免疫產(chǎn)生的特異性多克隆抗體用間接ELISA法進行檢測[13]。通過這種方法可以檢測到在綿羊奶中0.125～64.00%的牛奶和在干酪中的0.5～25.0%的牛奶，并且加熱處理和干酪的成熟過程不會對結果產(chǎn)生顯著的影響[14]。

3 單克隆抗體酶聯(lián)免疫法在乳制品摻假檢測中的應用

多克隆抗血清是由大量單克隆抗體組成的，這些單克隆抗體有不同的特異性抗原決定簇，因而要得到特異性高的抗體就需要大規(guī)模地親和吸附和使用其它異種蛋白來進行篩選[15]。

3.1 抗乳清蛋白單克隆抗體的應用

Levieux等人采用針對牛β乳球蛋白的單克隆抗體，利用雙抗夾心ELISA法對山羊和綿羊奶中的牛奶進行了檢測，此方法有很高的特異性和靈敏度并且重復性較好，可以檢測到1 份牛奶摻入到100 000 份綿羊奶及山羊奶中[16]。Negroni等人采用一種針對牛β乳球蛋白的單克隆抗體（MAb BLG-88N）作為捕獲抗體在改良雙抗夾心法中使用，可以檢測到0.03%的牛奶摻入到山羊奶中[17]。

3.2 抗酪蛋白單克隆抗體的應用

Anguita等人研究發(fā)現(xiàn)，β酪蛋白在牛所有的酪蛋白中都顯示出較高的抗原性[18]。因此，他們以牛β酪蛋白做抗原得到單克隆抗體（MAB AH4），使用間接ELISA法分別檢測未經(jīng)處理的、經(jīng)過巴氏殺菌和超高溫滅菌的牛奶在山羊奶或母羊奶中的摻入情況，檢測限可以達到0.5～10.0%[19]。山羊αs2酪蛋白被認為是山羊酪蛋白中免疫反應最強的，因此Haza等人針對山羊αs2酪蛋白制備單克隆抗體[20]，實驗所得的單抗與綿羊和牛的全酪蛋白均沒有明顯的交叉反應，其中的MAb B2B顯示出很強的專一性，并且其反應結果不會受到加熱處理的影響。應用該單抗進行間接ELISA檢測，可檢測到0.5～15.0%的山羊奶摻入母羊奶中[21]。之后，Haza等人又分別采用間接ELISA法和間接競爭ELISA法使用同一抗體定量檢測了山羊奶干酪摻入到母羊奶干酪中。結果表明，2 種方法可分別檢測1%～25%和0.5%～25.0%的山羊干酪摻入到母羊干酪中，并且發(fā)現(xiàn)檢測結果不會受到奶的加熱處理或干酪成熟的影響[22～23]。

4 小結

綜上所述，ELISA方法針對無論是微量的摻入還是經(jīng)過高溫處理的乳制品都可以進行準確地摻假鑒別。在制備單抗的過程中，來自不同物種的蛋白質之間的交叉反應可以采用雜交瘤技術被消除，并且能連續(xù)不斷地產(chǎn)生具有專一性的抗體。這些抗體特異性地識別牛奶中的某種蛋白質或者是某個特異性肽段，對進行不同種類乳制品的檢測具有重要意義，應用酪蛋白做抗原也可以克服在干酪成熟中干酪蛋白質水解對其抗原特性的影響。總之，針對乳制品中的摻假鑒別，ELISA法已經(jīng)發(fā)展成為一種非常靈敏、可靠的分析方法。今后的發(fā)展趨勢是進一步提高其特異性和靈敏度，通過與基因方法相結合的方式更加有效地鑒別乳制品中的摻假。

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