李冬燕 ，曹 榮 ，劉 淇 ，陳海華 ，殷邦忠

（1.青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071）

海參是中國傳統(tǒng)的滋補珍品，具有延緩衰老、防治腫瘤等多種功效[1]。近年來，中國海參產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，市場規(guī)模不斷擴大。然而，中國海參加工的技術水平和綜合利用程度還較低，加工過程中的下腳料（如海參腸、性腺等）尚未得到充分的開發(fā)利用。

酶解反應具有反應效率高、反應條件溫和、對氨基酸破壞小等優(yōu)點[2]。蛋白質經(jīng)酶解后其功能特性得到改善，具有更好的溶解性、乳化性、流變性等加工性能[3]。隨著酶技術的發(fā)展，酶法水解在水產(chǎn)加工下腳料綜合利用中的應用越來越廣泛[4]。筆者以海參腸為原料，對其水解用蛋白酶進行了篩選，在單因素分析基礎上，通過正交試驗對海參腸酶解的工藝條件進行了優(yōu)化，以期為提高海參的綜合利用率，開發(fā)海參功能食品提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 海參腸，由大連棒棰島海產(chǎn)企業(yè)集團有限公司提供。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：中性蛋白酶（1.3×105U/g）、木瓜蛋白酶（5.0×105U/g）、菠蘿蛋白酶（5.0×105U/g），均由吉寶（青島）生物科技有限公司提供。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器：SHA-B型恒溫振蕩水浴鍋（常州國華電器有限公司）；Centrifuge 5804R型冷凍離心機（上海富眾生物科學有限公司）；UV-2800型紫外可見分光光度計（尤尼克柯儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 水解度的測定 采用三氯乙酸（TCA）沉淀法[5]。取5.0 mL酶解液加入等體積的TCA溶液（質量分數(shù) 15%，w/v），靜置 20 min后，10 000 r/min離心10 min。取上清液，采用雙縮脲比色法測可溶性蛋白含量?？偟鞍缀康臏y定采用微量凱氏定氮法[6]。

按照如下公式進行水解度的計算：DH（%）=（N2-N1）/（N0-N1）×100

式中：DH（degree of hydrolysis）為水解度；N2為酶解液中15%TCA可溶性蛋白含量（mg）；N1為水解前海參腸勻漿液中15%TCA可溶性蛋白含量（mg）；N0為海參腸中總蛋白含量（mg）。

1.2.2 海參腸水解用酶的篩選 取海參腸加定量超純水后勻漿。勻漿液分別添加中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶及其復合物，在各自適宜條件下，進行水解試驗，根據(jù)水解度進行單酶的篩選，并確定雙酶復合的種類及其配比。

1.2.3 單因素試驗分析 在確定試驗用酶的基礎上，進行底物質量分數(shù)、酶用量、水解時間等單因素試驗，考察各因素對水解度的影響。

1.2.4 正交試驗設計 在1.2.3單因素試驗分析基礎上，采用三因素、三水平L9（34），進行正交試驗（表1），并進行方差分析，根據(jù)分析結果得到酶解海參腸的最佳工藝。

表1 正交試驗設計因素和水平

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗重復2次，每組試驗設3個平行，結果以平均值±標準偏差表示，應用SPSS 11.0統(tǒng)計處理軟件進行統(tǒng)計分析，顯著性界值以p<0.01為極顯著，p<0.05為顯著，p>0.05為不顯著。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白酶水解海參腸的效果比較

中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶是水產(chǎn)動物蛋白水解的常用酶。研究選取這3種蛋白酶，添加量為2 000 U/g原料，底物質量分數(shù)為10%，分別在其各自最適條件下進行水解。從圖1可以看出，3種蛋白酶的水解曲線有所不同，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對應的水解度基本是在3 h時達到最大，菠蘿蛋白酶對應的水解度在2 h時達到最大，水解度都是在開始階段迅速增加，之后增速變緩。其中，中性蛋白酶對應的水解度最高，為29.66%。

圖1 不同蛋白酶對海參腸的水解曲線

2.2 單酶復合對海參腸水解度的影響

在單酶試驗的基礎上，對3種蛋白酶兩兩復合，按照總酶量2 000 U/g原料、酶活比1∶1添加，底物質量分數(shù)10%，水解時間3 h。結果表明：中性蛋白酶+木瓜蛋白酶、中性蛋白酶+菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶+菠蘿蛋白酶的水解度分別為34.56%、32.11%、29.16%。雙酶對應的水解度要明顯高于單酶水解（p<0.05），中性蛋白酶與木瓜蛋白酶復合時水解度最大（34.56%），因此后續(xù)試驗選擇中性蛋白酶加木瓜蛋白酶進行復配。

2.3 復合酶中單酶配比對水解度的影響

按照中性蛋白酶與木瓜蛋白酶不同酶活比（總酶量2 000 U/g原料）、水解時間3 h、底物質量分數(shù)10%進行水解試驗。結果表明：當中性蛋白酶與木瓜蛋白酶酶活比為 1∶1、1∶1.5、1∶2、1.5∶1、2∶1 時，水解度分別為34.56%、37.73%、37.50%、40.93%、36.52%。雖然總的酶量相同，但不同的配比對應的水解度差別很大，中性蛋白酶與木瓜蛋白酶酶活比為1.5∶1時對應的水解度最大（40.93%），因此后續(xù)試驗中均采用中性蛋白酶與木瓜蛋白酶1.5∶1的配比。

2.4 海參腸復合酶解單因素試驗分析

采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照酶活比1.5∶1進行復配，進行海參腸水解的單因素試驗分析，結果見圖2。結果表明，隨底物質量分數(shù)的提高，海參腸的水解度先增大后減小，在底物質量分數(shù)5%左右達到最大；水解度隨酶量增加而增大，至酶量2 000 U/g原料時基本達到最大；在最初的1.5 h內水解度迅速升高，之后趨于平穩(wěn)。

圖2 底物質量分數(shù)

2.5 正交試驗結果及分析

海參腸復合酶解的正交試驗結果如表2所示，從極差值R可以得出，RA>RB>RC，說明影響水解度的因素依次為底物質量分數(shù)>加酶量>水解時間；從表3的方差分析結果可以看出，底物質量分數(shù)和加酶量對水解度的影響顯著；水解時間在選定的水平范圍內影響不顯著。其較優(yōu)組合為A2B3C1，即底物質量分數(shù)8%，加酶量3 000 U/g原料，水解時間2.5 h，在此條件下水解度可達到55.76%。

表2 正交試驗L9（34）結果

表3 正交試驗方差分析結果

3 討論與結論

筆者以海參腸為對象，采用蛋白酶水解的方式，以水解度為指標，通過正交試驗得到海參腸的最佳酶解工藝。研究結果顯示，雙酶水解的水解度要明顯高于單酶水解，這可能與酶的特異性有關。兩種酶的酶活比對水解度也有影響，該研究選取中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1.5∶1，在此條件下得到的水解度最大。通過正交試驗可以看出，雙酶復合水解海參腸的水解度受底物濃度、加酶量、水解時間等因素的影響，底物濃度和加酶量對水解度的影響顯著，水解時間在選定的水平范圍內影響不顯著。正交試驗最優(yōu)組合為底物質量分數(shù)8%，加酶量3 000 U/g原料，水解時間2.5 h，在此條件下水解度可達到55.76%。

水產(chǎn)動物蛋白水解多采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶等，或采用多種酶的復合物。實際生產(chǎn)中，酶的選擇應考慮水解效果、成本等多個因素。利用酶技術加工海參腸可以有效降低蛋白質分子量，增加多肽和氨基酸含量，最大限度保留海參腸的營養(yǎng)成分。筆者采用中性蛋白酶與木瓜蛋白酶復合進行海參腸的酶解，2.5 h內水解度可達到55.76%，有效地縮短了水解時間，簡化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本，為海參下腳料高值化利用提供了科學依據(jù)。

[1]張春云，王印庚，榮小軍，等.國內外海參自然資源、養(yǎng)殖狀況存在問題[J].海洋水產(chǎn)研究，2004，6（3）：89-90.

[2]周遠揚，雷百戰(zhàn)，潘 藝.酶技術在水產(chǎn)品加工下腳料利用方面的應用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2008，（7）：107-108.

[3]苑艷輝.水產(chǎn)品下腳料綜合利用研究之進展 [J].水產(chǎn)科技情報，2004，31（1）：44-48.

[4]Kuo C H.Purification of antioxidative peptides prepared from enzymatic hydrolysates of tuna dark muscle by-product[J].Food Chemistry，2010，122：42-48.

[5]檀志芬，生慶海.蛋白質水解度的測定方法 [J].分析檢測，2005，26（7）：175.

[6]無錫輕工業(yè)學院，天津輕工業(yè)學院.食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1996.