周 斌 ，黃道友 ，朱奇宏 ，饒中秀 ，劉守龍

（1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410125；2.中國科學(xué)院研究生院，北京100049）

國家環(huán)保總局的調(diào)查結(jié)果顯示，我國鎘污染的農(nóng)田面積已突破28萬hm2，年產(chǎn)鎘超標(biāo)農(nóng)產(chǎn)品達(dá)150萬t[1]。土壤鎘污染已成為我國的一個(gè)重要環(huán)境問題，嚴(yán)重威脅到了農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全和農(nóng)業(yè)區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。施用化學(xué)鈍化劑被認(rèn)為是修復(fù)利用鎘污染土壤的一種經(jīng)濟(jì)有效的途徑[2]。然而，鈍化劑的大量施用，不僅改變了土壤的基本理化性質(zhì)，也可能對(duì)土壤的微生物種群與生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響。因此，研究土壤微生物對(duì)鈍化劑儲(chǔ)備性施用的響應(yīng)，既是對(duì)其鈍化修復(fù)技術(shù)效果評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，也是對(duì)其進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估不可或缺的內(nèi)容。前人研究證實(shí)施用石灰[3-4]、鈣鎂磷肥[5-6]和海泡石[7]等鈍化劑，可以提高土壤的pH值，從而降低土壤中鎘的生物有效性[8]；有機(jī)鈍化劑[9]和海泡石[10]等則可通過吸附作用，從而減少土壤中的重金屬有效性。本課題組通過田間小區(qū)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鎘污染稻田通過儲(chǔ)備性施用石灰、鈣鎂磷肥、海泡石和腐植酸礦粉等鈍化劑，能顯著降低土壤中的有效態(tài)鎘含量，減少水稻對(duì)鎘的吸收和積累[7]。土壤微生物和土壤酶不僅推動(dòng)著土壤有機(jī)質(zhì)的礦化分解與養(yǎng)分物質(zhì)的循環(huán)與轉(zhuǎn)化，而且還是表征土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，能敏感地反映土壤環(huán)境的微小變化[11]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，末端限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（T-RFLP）技術(shù)已經(jīng)成功的應(yīng)用于土壤微生物群落的分析[12-14]。采用T-RFLP技術(shù)可以分析群落間差異，比較群落相對(duì)豐度和結(jié)構(gòu)，識(shí)別群落中具體物種[15]。以往關(guān)于鎘污染土壤施用鈍化劑的研究主要是關(guān)注施用鈍化劑后對(duì)土壤中鎘的植物有效性以及植物對(duì)鎘的吸收和累積等方面，而有關(guān)土壤微生物和酶活性對(duì)施用鈍化劑的響應(yīng)等方面的研究較為缺乏。本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)探討鎘污染稻田儲(chǔ)備性施用鈍化劑后土壤微生物對(duì)其的響應(yīng)，研究結(jié)果可為鈍化改良措施的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供數(shù)據(jù)支撐，并為鎘污染的鈍化修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)于2007年開始在湖南省某工業(yè)城市市郊進(jìn)行。試驗(yàn)點(diǎn)因土壤鎘污染，部分農(nóng)田棄耕，主要污染源為附近的一個(gè)小型電鍍廠，該廠已于2006年4月依法關(guān)閉。試驗(yàn)土壤發(fā)育于第四紀(jì)紅色黏土，其基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)

試驗(yàn)以當(dāng)?shù)亓?xí)慣種植為對(duì)照（CK），設(shè)石灰（L，含鎘0.14 mg/kg，按1.5 t/hm2一次性施入）、鈣鎂磷肥（P，含鎘2.1 mg/kg，按22.5 t/hm2一次性施入）、海泡石（S，主成分海泡石和石英，未檢出鎘，按22.5 t/hm2一次性施入）、腐植酸礦粉（H，含鎘0.28 mg/kg，按45 t/hm2一次性施入），共5個(gè)處理。每個(gè)處理3次重復(fù)。單個(gè)處理小區(qū)面積為20 m2，采用覆塑料薄膜（埋深20 cm）的田埂分隔，隨機(jī)區(qū)組排列。種植制度為中稻，水稻品種為“金優(yōu)207”。在第一季水稻移栽前7 d，所有鈍化劑一次性施入，然后人工耙勻，隨后不再施用，按照當(dāng)?shù)胤N植習(xí)慣進(jìn)行田間管理。

1.2 樣品采集與測(cè)試

2007年施鈍化劑前用不銹鋼土鉆采集各小區(qū)耕層土樣，自然風(fēng)干后分別過1mm和0.15mm尼龍篩，測(cè)定土壤的基本理化性質(zhì)。2009年10月水稻收獲后用不銹鋼土鉆采集各小區(qū)耕層土樣，一部分自然風(fēng)干后分別過1mm和0.15mm尼龍篩，測(cè)定土壤pH值、土壤有效態(tài)鎘和土壤酶活性；一部分自然風(fēng)干至含水量約40%，保存于4℃冰箱，用于測(cè)定土壤微生物生物量碳（Cmic）和微生物生物量氮（Nmic）。同時(shí)在采樣現(xiàn)場(chǎng)將部分土樣立即包裝放入液氮中，回實(shí)驗(yàn)室保存于-70℃冰箱，用于T-RFLP分析。

土壤Cmic用氯仿熏蒸、0.5 mol/L K2SO4提取，TOC-500自動(dòng)分析儀測(cè)定[16]；土壤Nmic用氯仿熏蒸、0.5 mol/L K2SO4提取，流動(dòng)注射分析儀測(cè)定[17]；土壤脲酶活性用苯酚鈉比色法測(cè)定，磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定，過氧化氫酶活性用高錳酸鉀滴定法測(cè)定[18-19]。采用SDS-GITC-PEG法提取土壤微生物總DNA[20]。DNA的濃度和純度用紫外分光光度計(jì)測(cè)定（Nanodrop，PeqLab，Germany）。

細(xì)菌16SrDNA基因PCR擴(kuò)增正向引物為8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反向引物為 926R（5′-CCGTCAATTC（A/C）TTTGAGTTT-3′），其中正向引物 5′端用6-羧基二乙酸熒光素（FAM）標(biāo)記。50 μL的PCR反應(yīng)體系組成如下：10×Taq DNA聚合酶緩沖液5.0 μL，MgCl22.5 mmol/L，dNTPs（each）0.2 mmol/L，正向和反向引物各 0.4 μmol/L，模板DNA100 ng，DNA聚合酶 Taq1（TaKaRa）1 U，ddH2O補(bǔ)水至 50 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95℃，5 min；40個(gè)循環(huán)為：(95 ℃，30 s；56 ℃，45 s；72 ℃，1 min)；72 ℃延伸10min。真菌ITS片段基因PCR擴(kuò)增正向引物為ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′），反向引物為 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），其中正向引物 5′端用6-羧基二乙酸熒光素（FAM）標(biāo)記。50 μL的PCR反應(yīng)體系組成如下：10×Taq DNA聚合酶緩沖液5.0 μL，MgCl22.5 mmol/L，dNTPs（each）0.2 mmol/L，正向和反向引物各0.4 μmol/L，模板 DNA100 ng，DNA 聚合酶 Taq1（TaKaRa）1U，ddH2O補(bǔ)水至 50 μL。PCR 反應(yīng)條件如下：95℃，5 min；40個(gè)循環(huán)為：(95 ℃，30 s；52 ℃，45 s；72 ℃，1 min)；72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，中國）純化，方法按說明進(jìn)行。純化后的細(xì)菌和真菌產(chǎn)物分別用HhaⅠ和TagⅠ消化，反應(yīng)體系50 μL，限制性內(nèi)切酶 20U，10×buffer 5 μL，DNA 300 ng，ddH2O 補(bǔ)水至50 μL。37℃下酶切反應(yīng)2 h，65℃下水浴10 min終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物送至上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序分析（Model373A，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

T-RFLP圖譜中每一個(gè)限制性片段（T-RF）作為一個(gè)OTU（operational taxonomic unit），T-RF片段大小±1 bp是同一個(gè)OTU，其豐度按照Thomas的方法計(jì)算[14]，即以相對(duì)峰高值 (每個(gè)T-RF的峰高除以累計(jì)峰高值)作為OTU豐度，相對(duì)誤差不超過10%。T-RFLP圖譜中限制性片段（T-RF）范圍在35 bp～550 bp，熒光值閾值超過100RFU，在平行實(shí)驗(yàn)的圖譜中重復(fù)再現(xiàn)的峰納入統(tǒng)計(jì)分析，片段相對(duì)豐度超過總T-RF豐度的10%定義為該樣品細(xì)菌和真菌的優(yōu)勢(shì)種群。

采用Shannon多樣性指數(shù)（Shannon Diversity，H）：H＝-Σ（pi）（Inpi）和均勻度指數(shù)（Evenness index，E）：E=H/Hmax（其中Hmax=lnS）進(jìn)行土壤真菌和細(xì)菌種群多樣性分析，其中Pi代表屬于某個(gè)OUT的個(gè)體在全部個(gè)體中的比例。

采用ANOVA法（P＜0.05或 P＜0.01，SPSS16.0）進(jìn)行差異性檢驗(yàn)；采用Canoca for windows 4.5軟件對(duì)細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行冗余分析（RDA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 施用鈍化劑對(duì)土壤酶活性和土壤微生物生物量的影響

酶作為土壤的重要活性物質(zhì)參與了土壤中的各種生化反應(yīng)，其活性大小可反映土壤的綜合肥力特征與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化進(jìn)程。由圖1可以看出，不同鈍化劑處理土壤的脲酶（圖1a）和磷酸酶（圖1b）的活性變化區(qū)間分別在0.09 mg/g·h～0.23 mg/g·h和 1.83 PNP mg/g·h～ 3.16 PNP mg/g·h之間，但各處理間的差異均未達(dá)到顯著水平。施用海泡石顯著提高了土壤過氧化氫酶的活性（與CK相比提高19.0%，P＜0.05），其他處理對(duì)過氧化氫酶活性未產(chǎn)生顯著影響（圖1c）。Lee等研究施用鈍化劑修復(fù)礦山污染土壤重金屬時(shí)發(fā)現(xiàn)，施用鈍化劑顯著降低了土壤重金屬的有效性，進(jìn)而引起土壤脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶活性等土壤微生物性狀的改善[21]。前期研究結(jié)果表明施用鈍化劑顯著降低了土壤鎘的有效性[7]，但對(duì)土壤脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶活性的影響有限，這可能是因?yàn)楸狙芯康耐寥梨k污染程度相對(duì)較低，鎘有效性降低對(duì)酶活性的影響有限所致。有研究指出，土壤pH值降低可能是導(dǎo)致過氧化氫酶活性降低的原因[22]，在本研究中，海泡石處理顯著提高了土壤pH值[7]，可能是其過氧化氫酶活性提高的主要原因。

圖1 施用鈍化劑對(duì)土壤脲酶（a）、磷酸酶（b）、過氧化氫酶（c）、微生物生物量（d）的影響

土壤微生物生物量是反映土壤環(huán)境質(zhì)量的重要微生物學(xué)參數(shù)，對(duì)人為活動(dòng)、重金屬污染等外界條件的變化反應(yīng)比較敏感。由圖1（d）可以看出，施用鈍化劑后土壤Cmic呈升高趨勢(shì)，但處理間差異并未達(dá)到顯著水平，這與前人的研究結(jié)果是一致的[23，24]。然而，施用石灰和腐植酸礦粉后土壤Nmic顯著降低，降低幅度分別為33.0%和33.8%，施用鈣鎂磷肥則使土壤Nmic顯著提高（增幅44.9%）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，施用石灰和腐植酸礦粉顯著提高了Cmic/Nmic，而施用鈣鎂磷肥則顯著降低了Cmic/Nmic。這表明供試4種鈍化劑在修復(fù)鎘污染稻田過程中，雖然對(duì)土壤微生物生物量影響有限，但可能改變了土壤微生物種群結(jié)構(gòu)。

2.2 施用鈍化劑對(duì)土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的影響

由于核苷酸序列具有多態(tài)性，所以同一個(gè)基因的DNA片段在相同的酶切后可能得到長度不同的T-RF，通過對(duì)T-RF以及由此生成的T-RFLP圖譜的分析，可以揭示樣品中微生物的種類和數(shù)量等信息，從而解析微生物群落的結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化[25]。大多數(shù)情況下，可以粗略的認(rèn)為每個(gè)T-RF對(duì)應(yīng)著一個(gè)微生物物種。利用限制性內(nèi)切酶Hha I和Taq I酶切的T-RFLP圖譜，根據(jù)末端限制性片斷的數(shù)目及其豐度，分別計(jì)算了不同鈍化劑處理稻田土壤細(xì)菌、真菌香農(nóng)指數(shù)（Shannon）和均勻度指數(shù)（Evenness）。結(jié)果表明（表 2），細(xì)菌Shannon指數(shù)介于3.83～4.23之間，Evenness指數(shù)介于0.85～0.96之間；真菌Shannon指數(shù)介于4.11～4.48之間，Evenness指數(shù)介于0.79～0.94之間。施用鈍化劑后的土壤細(xì)菌和真菌Shannon指數(shù)和Evenness指數(shù)均呈降低趨勢(shì)，其中海泡石和腐植酸礦粉處理的真菌Shannon指數(shù)顯著低于對(duì)照，海泡石、腐植酸礦粉和鈣鎂磷肥處理的Evenness指數(shù)顯著低于對(duì)照?？梢姡┯免g化劑顯著降低了土壤真菌的多樣性。

表2 鈍化劑對(duì)鎘污染稻田土壤細(xì)菌和真菌多樣性的影響

用Hha I和Tag I酶切細(xì)菌和真菌DNA后分別檢測(cè)到21和27個(gè)相對(duì)豐度大于1%的T-RF（圖2）。由圖2a可知，施用鈍化劑后土壤細(xì)菌的T-RF均出現(xiàn)了新增片段，其相對(duì)豐度占總T－RF的比例在18%～30%之間，雖然未出現(xiàn)原有T-RF的缺失，但其相對(duì)豐度都有不同程度的降低，如36bp、92bp、59bp和106bp等。由圖2b可知，施用鈍化劑后真菌缺失了部分T-RF（52bp、55bp、270bp等），同時(shí)新增了部分T-RF，其相對(duì)豐度占總T-RF的比例在9%～31%之間。由此可見，鈍化劑儲(chǔ)備性施用修復(fù)鎘污染稻田使土壤細(xì)菌和真菌種群結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯變化，這也驗(yàn)證了土壤微生物生物量變化的結(jié)果。Karaca等發(fā)現(xiàn)添加50 mg/kg鎘培育的污染土壤（砂壤土）施用污泥和磷肥后，細(xì)菌和假單胞菌的種群豐度顯著提高[26]。還有研究發(fā)現(xiàn)，在鉛、鎘和鋅復(fù)合污染酸性土壤上施用紅泥、石灰和沸石能夠有效提高土壤微生物種群豐度（Biolog法）[27]。這與本研究的結(jié)果不同，可能因?yàn)槠溲芯康耐寥乐亟饘傥廴境潭葮O高，重金屬對(duì)土壤微生物的毒害作用更強(qiáng)，施用鈍化劑后重金屬有效性顯著降低，進(jìn)而改善了土壤微生物性狀。重金屬污染程度相對(duì)較輕的土壤（如本試驗(yàn)）施用鈍化劑后對(duì)土壤微生物性狀的改善作用可能相對(duì)較弱。Mench等研究也表明鎘、鎳污染程度不高的土壤采用棕閃巖和鐵砂作為鈍化劑，對(duì)細(xì)菌豐度無顯著影響[24]。

圖2 鈍化劑對(duì)鎘污染稻田土壤細(xì)菌(a)、真菌(b)T-RF相對(duì)豐度的影響

2.3 環(huán)境因素對(duì)土壤細(xì)菌和真菌分布的影響

通過冗余分析（Canoco4.5軟件）土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子間的關(guān)系，探討了施用鈍化劑對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響的機(jī)理。結(jié)果表明，有效態(tài)鎘和pH值顯著影響土壤細(xì)菌群落（圖3a，P值分別為0.002和0.032），Nmic、pH值和有效態(tài)鎘顯著影響土壤真菌群落（圖3b，P值分別為0.002、0.002、0.008）。我們前期的研究結(jié)果表明，石灰、鈣鎂磷肥、海泡石和腐植酸礦粉主要通過提高土壤pH值，進(jìn)而降低土壤中鎘的有效性的。由此可見，土壤pH值變化可能是引起土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的原因。李江濤等[28]也發(fā)現(xiàn)土壤pH值變化是真菌群落的主要影響因素；袁紅朝等[29]的研究結(jié)果表明，土壤pH值變化會(huì)導(dǎo)致土壤中對(duì)環(huán)境變化敏感的細(xì)菌種群豐度發(fā)生變化。

3 結(jié)論

通過田間小區(qū)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，儲(chǔ)備性施用鈍化劑修復(fù)鎘污染稻田，對(duì)土壤微生物生物量碳和脲酶、磷酸酶及過氧化氫酶活性的影響較小，但施用石灰和海泡石使土壤Nmic顯著降低，而施用鈣鎂磷肥使Nmic則顯著提高；T-RFLP的分析結(jié)果顯示，鈍化劑儲(chǔ)備性施用使土壤T-RF的豐度發(fā)生了顯著變化，出現(xiàn)部分T-RF的缺失和新T-RF的產(chǎn)生，土壤細(xì)菌和真菌的多樣性指數(shù)均呈降低趨勢(shì)，這表明施用鈍化劑修復(fù)鎘污染稻田顯著改變了土壤細(xì)菌和真菌的種群結(jié)構(gòu)，土壤pH值是影響細(xì)菌和真菌群落組成的主要因素。然而，施用鈍化劑后缺失的T－RF和新增的T－RF對(duì)應(yīng)的真菌和細(xì)菌種類尚不清楚，其功能也未知，需要進(jìn)一步開展研究。

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