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        醋制南五味子抗α-淀粉酶活性部位篩選*

        2012-07-09 07:06:36蒙躍龍董彬廠陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院咸陽712046
        陜西中醫(yī) 2012年11期
        關(guān)鍵詞:緩沖溶液水楊酸正丁醇

        蒙躍龍 董彬廠 鄧 翀 陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院(咸陽712046)

        南五味子為木蘭科華中南五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的果實,有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的作用。炮制方法主要有醋制、酒制、蜜制、炒制、蒸制等。生品以斂肺止咳為主,用于自汗盜汗,口干作渴;醋制后增強酸澀收斂之性。近幾年文獻(xiàn)報道五味子具有抗糖尿病的生理活性。西方醫(yī)學(xué)通過化學(xué)合成法尋找α-淀粉酶抑制劑取得了一定進(jìn)展,但合成藥物對糖尿病患者的耐藥性與副作用也日益明顯,尋找安全、有效的天然α-淀粉酶抑制已被提上日程。本研究采用酶法測定南五味子炮制前后不同化學(xué)部位對α-淀粉酶抑制活性,為五味子輔助降糖新藥研發(fā)提供一定的依據(jù)。

        1 試藥和儀器

        1.1 藥材 南五味子購于陜西南鄭縣,經(jīng)王繼濤高級實驗師鑒定為木蘭科華中南五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的成熟果實。

        1.2 試劑試液 α-淀粉酶(北京奧博星生物技術(shù)有限公司,20120205);可溶性淀粉(天津市天力化學(xué)試劑有限公司,批號20110308);阿卡波糖(天津西瑪科技有限公司,批號20120301);3,5-二硝基水楊酸(上??曝S化學(xué)試劑有限公司,批號20101009)3,5-二硝基水楊酸試液(取3,5-二硝基水楊酸6.5g加入325mL的2mol·L-1氫氧化鈉和45mL丙三醇,再加入蒸餾水至1000mL,充分溶解,室溫存放備用);0.2mol·L-1PH=5.6檸檬酸緩沖溶液、0.12mol·L-1PH=6.1磷酸鹽緩沖溶液,其它試劑均為分析純。

        1.3 儀器 UV1102型紫外可見分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司),F(xiàn)A2004N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)PHS-3C型雷磁精密PH計。

        2 方 法

        2.1 南五味子各提部位的制備 稱取炮制前后南五味子藥粉各10g,分別以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水10倍量溶劑各提取兩次,每次1h,合并各溶劑濾液并蒸干。氯仿和乙酸乙酯提取部位均用無水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移置25mL量瓶中定容;正丁醇提取部位用80%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移置25mL量瓶中定容(將定容后的炮制前后正丁醇提取部位溶液稀釋十倍再進(jìn)行測定);水提取部位用蒸餾水溶解轉(zhuǎn)移置100mL量瓶中定容,將制備好的各樣品提取部位溶液密封4℃冷藏放置,待用。

        2.2 α-淀粉酶活性的測定原理 采用3,5-二硝基水楊酸方法(3、5-dinitrosalicylic acid、colorimetric assays,Bernfeld method)測定α-淀粉酶活性,Bernfeld法是通過確定可溶性淀粉在α-淀粉酶作用下水解產(chǎn)生的還原基團(tuán)將3,5-二硝基水楊酸還原為硝基氨基水楊酸(棕紅色物質(zhì)),還原基團(tuán)的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺程度成一定的比例關(guān)系,在波長520 nm處測定棕紅色物質(zhì)和陽性對照阿卡波糖的吸光值(A)[1],由于α-淀粉酶抑制劑對淀粉水解有抑制作用,可使A520值下降,從而可以計算待測物對淀粉酶活性的抑制率。

        2.3 南五味子各提取部位抑制α-淀粉酶活性的測定方法 設(shè)α-淀粉酶管、各不同提取部位管、陽性對照管、α-淀粉酶空白對照管、各提取部位空白對照管、陽性對照空白管。炮制前后各提取部位管中加入0.4mL提取液揮干溶劑并加0.4mL磷酸鹽緩沖溶液溶解后,加入0.4mL檸檬酸緩沖液、0.8mL 8mg·mL-1淀粉溶液[2](用檸檬酸緩沖溶液配制)、2mL 4mg·mL-1α-淀粉酶液[3],總反應(yīng)體積為3.6mL。

        將各管內(nèi)溶液混勻,37℃水浴保溫30min后,分別加入6mL 3,5-二硝基水楊酸溶液,搖勻,置于100℃水浴保溫10min,冷卻置室溫,分別取各管反應(yīng)液1mL加入9mL蒸餾水于520nm處檢測吸光度值(A)。

        α-淀粉酶抑制率計算公式如下:

        3 結(jié) 果 南五味子炮制前藥材中乙酸乙酯提取部位的抑制作用最強,其次為氯仿和正丁醇提取部位,水提取部位的抑制作用最弱。炮制后藥材中乙酸乙酯提取部位的抑制作用最強,其次為正丁醇和氯仿提取部位,水提取部位抑制作用最弱。南五味子醋制后各化學(xué)部位抗α-淀粉酶活性強于其炮制前對應(yīng)各化學(xué)部位。

        表1 炮制前后南五味子提取部位對α-淀粉酶抑制率(n=5)

        4 討 論 α-淀粉酶抑制劑能有效抑制唾液和胰液α-淀粉酶活性,阻礙食物中碳水化合物的分解和消化,減少葡萄糖產(chǎn)生和攝取,從而可以有效防止糖尿病和高血脂癥。因此,α-淀粉酶抑制劑常被用于治療II型糖尿病,可有效降低餐后血糖水平和減少糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[4]。

        α-淀粉酶由于受溫度和PH的影響很大故應(yīng)使用前配制,可溶性淀粉的溶解性對實驗結(jié)果影響較大,故應(yīng)先將0.2mol·L-1檸檬酸鹽緩沖溶液加熱到100℃加入可溶性淀粉,攪拌,使之迅速溶解,冷卻至室溫再用檸檬酸緩沖液調(diào)至所需濃度。為了保持各待測組的平行,應(yīng)將淀粉溶液最后加入。

        實驗結(jié)果中南五味子炮制前后乙酸乙酯提取部位對α-淀粉酶活性抑制作用最強,而正丁醇部位在炮制前后抑酶率變化較大。南五味子炮制后各部位抗α-淀粉酶活性強于其炮制前各部位。南五味子炮制前后各化學(xué)部位抗α-淀粉酶活性比較可知,氯仿、乙酸乙酯、正丁醇化學(xué)部位抗α-淀粉酶活性明顯。

        [1]B.施特爾巴赫著,錢喜淵譯.酶的測定方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1992:37-41.

        [2]趙修南,賈啟燕,單俊杰.α-淀粉酶抑制劑篩選方法的優(yōu)選[J].2008,35(5):321-324.

        [3]吳慧平,陳建偉,許婷婷,等.骨碎補與夜交藤組合物對α-糖苷酶活性的影響[J].2012,18(5):181-184.

        [4]徐林峰,沈忠明,殷建偉,等.五味子中提取α- 葡萄糖苷酶抑制劑的研究[J].中國生化藥物雜志,2001,22(3):127.

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