陳婭萍 史廷嬌 高淞文 唐丁卯 鄧 葵 李春艷

1．湖南省吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院07級臨床醫(yī)學(xué)，湖南 吉首 416000;2．湖南省吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實驗教研室，湖南 吉首 416000

黃瓜香學(xué)名蔓莖堇菜、葡付堇，屬堇菜科，堇菜屬(Viola diffusa Ging)，多年生草本植物，是盛產(chǎn)于湖南湘西等地區(qū)的一種中草藥。其主要化學(xué)成分為黃酮類，具有清除自由基，抑制過氧化損傷作用［1－2］。本實驗室以黃瓜香為研究對象，對它的活性成分——總黃酮進(jìn)行提取分離，并用傳代培養(yǎng)的肝HapG2細(xì)胞，通過H2O2建立氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型，研究總黃酮對肝HapG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為實現(xiàn)黃瓜香提取物在臨床上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、TGL216G高速臺式離心機(jī)、UV－3系列紫外可見分光光度計、酶聯(lián)免疫檢測儀、全自動生化分析儀 (均為上海美譜達(dá)儀器有限公司)。25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板 (均購于碧云天公司)。

1.1.2 試劑和藥品 黃瓜香醇提物，傳統(tǒng)方法醇提、濃縮，臨用時用雙蒸水稀釋成所需濃度 (實驗所用劑量均以生藥計)，并用0.22um濾過膜濾過。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS液(均由碧云天公司提供)，雙氧水 (成都化工原料有限公司)，二醛 (MDA)試劑盒、基噻唑藍(lán) (MTT)、ALT測試劑盒(均購于碧云天公司)，無水乙醇、乙醚等其它化學(xué)試劑均為分析純，雙蒸水 (吉首大學(xué)創(chuàng)新實驗室提供)。

1.1.3 細(xì)胞 肝細(xì)胞為HapG2細(xì)胞，購于武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 黃瓜香總黃酮的分離純化

本實驗所用黃瓜香采自湖南湘西，夏末采集，全植物干燥后粉碎，加入60%的乙醇，80℃條件下提取，提取液經(jīng)過濾、乙醚萃取、再過濾，得黃瓜香提取物 (總黃酮)。

1.2.2 肝細(xì)胞培養(yǎng)及損傷模型的建立

將原代HapG2細(xì)胞，加入胰蛋白酶溶液8ml，37℃消化，蓋好瓶蓋在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，倒掉胰酶，加入含10%牛胎血清的新鮮培養(yǎng)基10ml，稀釋成含5×106/L個細(xì)胞細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中和6孔板 ，96孔培養(yǎng)板100μl/孔，6孔板2ml/孔，置 CO2培養(yǎng)箱 (5%CO2，95%空氣，37℃)中培養(yǎng)2h。待細(xì)胞長至對數(shù)期后分組實驗:對照組:只加入含牛胎血清的培養(yǎng)基孵育1h;H2O2損傷模型組 (H2O2):加入0.6mmol/L H2O210ul，孵育1h，建立氧化應(yīng)激損傷模型;黃瓜香－1.0、3.0、10.0、30.0干預(yù)組:每組分別加入終質(zhì)量濃度為 1.0mg/L、3.0mg/L、10.0mg/L、30.0mg/L的黃瓜香及0.6mmol/L的H2O2孵育1h;每組設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3 MTT法檢測 將三個分組分別加入 DMSO 100 ul/孔，按試劑盒說明步驟，待甲臜完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長570nm處讀取吸光度 (A 570)。

1.2.4 ALT的檢測 將分組實驗后肝細(xì)胞經(jīng)離心 (1800r/min，10min)后收集上清，按試劑盒說明書步驟操作，用全自動生化分析儀速率法檢測，結(jié)果以U/孔表示。

1.2.5 MDA含量的測定 用胰蛋白酶消化分組培養(yǎng)至貼壁的HapG2細(xì)胞細(xì)胞，收集2×106細(xì)胞，用PBS洗2次。待細(xì)胞分散后，將各組細(xì)胞的培養(yǎng)液倒掉，將細(xì)胞裂解后，根據(jù)試劑盒說明步驟操作，測定MDA含量，可見光分光光度計532 nm測上清液的吸光值，吸光值表示丙二醛含量的多少，吸光值越大，丙二醛含量越高，結(jié)果以mmol/孔計。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用±s表示，計量指標(biāo)用方差分析。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，相差顯著;P＜0.01時為相差非常顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜香總黃酮對H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞增殖的影響

MTT實驗是檢測細(xì)胞活力的實驗方法，活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲臜顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍，其量與細(xì)胞數(shù)呈正比，也與細(xì)胞活力呈正比［3］。因此MTT常常用來檢測細(xì)胞的增殖情況。采用熒光免疫法測定細(xì)胞活性 (MTT)，以實驗分組為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制柱狀圖，見圖1。

由圖1可知，與模型組比較:對照組HapG2細(xì)胞增殖活躍 (P＜0.01);黃瓜香各劑量組HapG2細(xì)胞增殖隨黃瓜香濃度的增加而逐漸增加 (黃瓜香濃度為3.0mg/L時P＜0.05，黃瓜香濃度為10.0mg/L時P＜0.01)，說明黃瓜香總黃酮能促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的肝HapG2細(xì)胞的增值。

2.2 黃瓜香總黃酮對H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞受損的影響

ALT是一種非血漿特異酶，是肝功能檢驗的重要指標(biāo)，是反映肝細(xì)胞受損最敏感的指標(biāo)［4］。采用全自動生化分析儀速率法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液ALT的水平，觀測黃瓜香總黃酮對H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞受損的影響程度，結(jié)果見圖2。由圖2可知，與模型組比較:對照組HapG2細(xì)胞無明顯受損 (P＜0.01);黃瓜香各劑量干預(yù)組HapG2細(xì)胞受損明顯降低 (黃瓜香濃度為3.0mg/L時P＜0.05，黃瓜香濃度為10.0mg/L時P＜0.01)，說明黃瓜香總黃酮能降低H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞受損，具有保護(hù)肝HapG2細(xì)胞的作用。

2.3 黃瓜香總黃酮對H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的影響

MDA是介導(dǎo)自由基損傷的重要物質(zhì)，可與蛋白質(zhì)、核酸、堿基、生物胺、磷脂等含有氨基的物質(zhì)作用而發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致生物大分子及生物膜結(jié)構(gòu)的損傷［5］。其作為生物膜磷脂中多不飽和脂肪酸受自由基攻擊而產(chǎn)生的終產(chǎn)物之一，可以反映出體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷的水平。分光光度法檢測細(xì)胞丙二醛 (MDA)水平，檢測黃瓜香總黃酮對H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞受損的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，與模型組比較:對照組肝HapG2細(xì)胞無明顯脂質(zhì)過氧化損傷 (P＜0.01);黃瓜香各劑量組HapG2細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷程度隨黃瓜香濃度的增加逐漸降低(黃瓜香濃度為 3.0mg/L時 P＜0.05，黃瓜香濃度為10.0mg/L時P＜0.01)，說明黃瓜香總黃酮能抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞的損傷。

3 結(jié)論與討論

黃瓜香化學(xué)成分主要為黃酮、糖類、粘液質(zhì)［6］。植株總黃酮含量為2.39%，根總黃酮含量為1.08%，細(xì)胞懸浮物總黃酮含量為0.76%［7］。本實驗采用 H2O2誘導(dǎo)肝HapG2細(xì)胞損傷，建立體外氧化應(yīng)激損傷模型。實驗選用了0.6mmol/L H2O2誘導(dǎo)損傷1h，使肝細(xì)胞處于尚能保護(hù)的自由基環(huán)境，保證了實驗的可行性，與某些文獻(xiàn)報道的濃度基本吻合［8］。

本實驗顯示:黃瓜香總黃酮具有很強(qiáng)的體外抗氧化能力，可以促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的肝HapG2細(xì)胞的增殖，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對氧化應(yīng)激狀態(tài)中的肝HapG2細(xì)胞具有保護(hù)作用。黃瓜香濃度為3.0mg/L時有統(tǒng)計學(xué)差異，濃度為10.0mg/L有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。提示黃瓜香能有效減低氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮對肝細(xì)胞的保護(hù)作用。其機(jī)制可能與生物類黃酮藥理作用一致:黃瓜香水提物中所含有的黃酮，能提供大量的酮羥基還原自由基，從而起到抗自由基作用。且體外試驗還表明:黃瓜香提取物對·OH均具有良好清除作用，且濃度愈大清除率愈高［9］，表明黃瓜香提取物是良好的羥自由基清除劑，能減輕H2O2引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，并對肝細(xì)胞有保護(hù)作用。弄清楚黃瓜香抗肝損傷的機(jī)制，并對其進(jìn)行開發(fā)，不僅具有重要的社會效益而且具有重要經(jīng)濟(jì)效益。

［1］孫福祥，楊明霞，娜仁花，等.棗總黃酮對阿霉素所致紅細(xì)胞過氧化的抑制作用［J］．中成藥，2001，23(8):606．

［2］李春艷，李先輝，呂江明，等．黃瓜香提取物對小鼠免疫功能調(diào)節(jié)的實驗研究［J］．時珍國醫(yī)國藥，2008，19(149):41－42．

［3］司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正．細(xì)胞培養(yǎng)［M］．西安:世界圖書出版公司，2004:198:220．

［4］康格非．臨床生物化學(xué)和生物化學(xué)檢驗［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，1998:160．

［5］文漢，聶凡．絞股藍(lán)提取物對自由基清除能力的初步研究［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，29(1):121－122．

［6］陳由強(qiáng)，林國宇，等．蔓莖堇菜總黃酮含量的測定［J］．福建師范大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版)，2000，4(16):67 －69．

［7］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會．中國植物志．［M］．北京:科學(xué)出版社，1991，51:35－36．

［8］尹小萍，林冠宇，寶麗，等．正膏坊龜苓膏對氧化應(yīng)激狀態(tài)的改善作用［J］．食品科學(xué)，2009，30(5):239－243．

［9］楊俊林，沈恂．生物系統(tǒng)中活潑中間體與脂質(zhì)過氧化［J］．學(xué)通報，1997:(6):5．