西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院骨二科（西安710004） 臧全金 歷 強 朱振中 賀西京

星形膠質細胞（Astrocytes，AST）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有穩(wěn)定神經(jīng)元結構、營養(yǎng)支持神經(jīng)突觸微環(huán)境物質代謝及參與血腦屏障形成的作用［1］。同時，AST可以通過分泌遞質調節(jié)神經(jīng)元的活動，參與神經(jīng)系統(tǒng)的信息整合和信號傳導［2，3］。最新研究發(fā)現(xiàn)側腦室下區(qū)和海馬齒狀回的神經(jīng)干細胞其本質可能就是局部的AST［4，5］，從而引起人們對該區(qū)域神經(jīng)干細胞特性研究的重視。目前體外研究的AST均來源于胚胎以及新生動物，其與成年動物AST在生物學特性及功能上存在較大差異，不能成為理想的細胞來源。而成年動物的AST已經(jīng)高度分化成熟，在體外培養(yǎng)情況下難以存活，即使存活其純度也不能令人滿意。文獻報道的用于研究的AST純度為75%，其中主要混雜的是成纖維細胞［6］。因此，有必要探索成年哺乳動物側腦室下區(qū)AST培養(yǎng)純化方法，為體外深入研究成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)AST細胞特性以及以后臨床應用提供參考。

材料與方法

1 實驗材料 成年SD大鼠200～250g，≥2.5月，雌雄不限，由西安交通大學醫(yī)學實驗動物中心提供；胎牛血清（FBS）、DMEM／F12培養(yǎng)基（DF12）、胰蛋白酶、B27添加劑購自 Gibco公司；EDTA、Poly－L－lysine、牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma公司；小鼠抗大鼠GFAP單克隆抗體（mAb）購自Chemicon公司；Hoechest33342、抗兔FITC偶聯(lián)熒光二抗購自Molecular Probe公司；Leica倒置相差顯微鏡購自Leica公司；Olympus BX51型熒光顯微鏡及FV1000型激光共聚焦顯微鏡購自Olympus公司。

2 實驗方法

2.1 成年大鼠室下區(qū)的取材及培養(yǎng) 按照Alvarez－Buylla方法［7］取材成年大鼠側腦室下區(qū)。將獲取的室下區(qū)腦組織剪碎后加入適量1.25g／L胰酶＋0.02g／L EDTA，置于37℃培養(yǎng)箱消化25min后加入適量血清中止消化。D－Hanks液漂洗后用火焰拋光的Pasteur管吹打并過200目濾網(wǎng)制成單細胞懸液。將細胞接種于Poly－L－lysine預處理的25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，置于50ml／L CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)30 min。取出后晃動培養(yǎng)瓶至顯微鏡下觀察見只有少數(shù)展開細胞貼壁時將細胞懸液吸出，離心后移入DF12＋10ml／L FBS＋2g／L B27培養(yǎng)基中，在相差顯微鏡下進行活細胞計數(shù)，調整細胞密度至1×108／L后接種于Poly－L－lysine預處理的塑料培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗組細胞接種后第3天全量換液將培養(yǎng)液改為DF12＋2ml／L FBS＋2g／L B27，然后按照隔日半量換液，培養(yǎng)至7～9d時將培養(yǎng)液改為DF12＋5ml／L FBS＋2g／L B27。對照采用非低濃度血清，培養(yǎng)液為DF12＋10ml／L FBS＋2g／L B27；非血清調整組：培養(yǎng)液DF12＋5ml／L FBS＋2g／L B27，對照組每隔兩天常規(guī)換液。定期于Olympus倒置相差顯微鏡下觀察并比較不同時期AST形態(tài)結構的變化。

2.2 AST的免疫細胞化學鑒定和純度檢測將培養(yǎng)14～15d的AST細胞用預溫的0.01mol／L PBS清洗2次，然后用40g／L多聚甲醛溶液固定25～30min，0.01mol／L PBS清洗3次。加入 10g／L BSA封閉1h，棄去封閉液加入抗大鼠GFAP mAb（1∶1000）。4℃孵育24h。然后用0.01mol／L PBS清洗3次，每次10min，加入FITC結合熒光二抗（1∶400）室溫作用3h，0.01mol／L PBS清洗3次，每次10min，最后加入 Hoechest 33342（100g／L）作用20 min，常規(guī)PBS清洗后用60%甘油封片。同時設立陰性對照組，用10g／L BSA代替一抗。于BX51型O－lympus熒光顯微鏡下觀察陽性細胞著色情況并且計算細胞的純度。方法：在200倍鏡下隨機選擇15個視野在488nm激發(fā)光下進行FITC陽性細胞計數(shù)，同時在405nm激發(fā)光下計數(shù)相同視野內的所有Hoechst 33342陽性細胞核數(shù)量。細胞純度為相同視野下FITC陽性細胞占所有Hoechst 33342陽性細胞核數(shù)的比值，獨立實驗重復3次后求平均值。

結 果

1 形態(tài)學顯示 細胞接種后2h絕大部分細胞貼壁，呈圓形或類圓形，折光性強，大小較一致。此時，視野中可見折光性較弱的細胞碎片，未見明顯的成纖維細胞（見圖1A）；實驗組及非血清調整組細胞生長至第4天，出現(xiàn)了少量的較為典型的AST樣集落，以纖維型AST為主，細胞多呈雙極或三極條索樣排列；偶可見極少量的成纖維細胞集落（見圖1B），而此時非低濃度血清組出現(xiàn)大量的成纖維細胞集落，呈梭狀，放射狀排列；6d時，實驗組及非血清調整組原有的AST樣集落進一步增大，集落中細胞可見原漿型AST增多，集落由條索狀轉變?yōu)槠瑺??？梢娚倭康某衫w維細胞及空泡狀的小膠質細胞混雜（見圖1C），此時非低濃度血清組成纖維細胞大量增殖，鋪滿瓶底，僅可見極少數(shù)AST樣集落，此狀態(tài)維持至實驗結束；9d時，前兩組原有的AST樣集落繼續(xù)增大，集落間細胞出現(xiàn)不同程度的交織，連接成網(wǎng)狀，集落中成纖維型／原漿型AST比例與前相似，總體生長速度較為穩(wěn)定。此時小膠質細胞、少突膠質細胞及成纖維細胞較前增多，可見少量成纖維細胞集落（見圖1D），以非血清調整組為多；培養(yǎng)9～12d時，細胞生長速度明顯增快，原來呈網(wǎng)格狀連接的AST集落匯集成片狀，以原漿型AST為主。小膠質細胞出現(xiàn)不同程度的脫落，成片狀漂浮于培養(yǎng)基上（見圖1E），視野中空泡狀的小膠質細胞數(shù)量下降。成纖維細胞集落增長不明顯；培養(yǎng)至14d時，培養(yǎng)瓶底部鋪滿AST，細胞多呈圓形或類圓形，以原漿型占多數(shù)，折光性不強。胞體大、胞質豐富，胞突較多。此時，小膠質細胞及少突膠質細胞的比例明顯下降，細胞總體純度較高（見圖1F）。

2 免疫細胞化學顯示 非低濃度血清組培養(yǎng)至6d時大量成纖維細胞增殖，僅有極少量散在分布的AST樣集落。實驗組及非血清調整組AST經(jīng)GFAP免疫細胞化學染色后絕大部分呈GFAP陽性染色，成纖維細胞數(shù)量較少，胞體未著色。熒光顯微鏡下可見AST呈纖維狀聚集或類圓形散在生長（見圖2A），細胞胞質著色較深，高倍視野下細胞骨架形態(tài)清晰可見（見圖2B），細胞核未著色而呈空泡樣。對照組胞質部分未見明顯的陽性著色，只有模糊的非特異性背景著色，沒有明顯的細胞核空缺區(qū)（見圖2C）。按照上述方法在200倍視野下隨機選取15個視野，計算GFAP陽性著色細胞占所有細胞的比例，非低濃度血清組、非血清調整組、實驗組細胞純度分別為28%，74%，91%。提示低濃度血清結合血清濃度調整法是一種有效的純化成年AST的方法。

圖1 星形膠質細胞鏡下形態(tài)學顯示

圖2 星形膠質細胞GFAP免疫組化染色

討 論

星形膠質細胞具有神經(jīng)干細胞特性的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路。目前，體外培養(yǎng)AST多來源于胚胎或者新生哺乳動物，采用Mccarthy介紹的DF12＋10ml／L FBS培養(yǎng)基、37℃恒溫搖床法進行純化。但是，胚胎本身的幼稚性并不能準確地反映成年動物AST的特性。同時，胚胎或者新生動物來源的AST數(shù)量多、增殖快，成纖維細胞的污染較少。成年動物側腦室下區(qū)取材量較少，細胞在體外的增殖速度慢，其中最突出的問題是成纖維細胞的污染。因此，在成年哺乳動物AST培養(yǎng)的過程中要選擇適當純化方法，既能使AST生長、增殖，又能最大限度地去除或抑制成纖維細胞的生長。

目前抑制成纖維細胞生長的方法主要有阿糖胞苷及Thy1.1－補體殺傷法，但是這些方法對AST活性損傷較大，不利于細胞生長、增殖。差速貼壁法是一種利用神經(jīng)膠質細胞與成纖維細胞貼壁速度存在明顯差異的特性，去除先貼壁的成纖維細胞的純化方法［8］，具有操作簡單、重復性好及費用低等優(yōu)點。然而我們在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，用差速貼壁法純化培養(yǎng)AST的具體差速時間難以準確把握，存在差速時間不足造成混雜細胞較多或差速過長導致細胞損失量較大的缺點，并不能有效地去除AST培養(yǎng)過程中混雜的成纖維細胞。B27添加劑中富含多種神經(jīng)細胞賴以生長的營養(yǎng)物質。單獨的B27添加劑可以作為神經(jīng)元培養(yǎng)的無血清限定性培養(yǎng)液，其對神經(jīng)系統(tǒng)其他細胞或細胞系的生長、增殖亦有著良好的促進作用，效果甚至可以和膠質細胞限定性G5培養(yǎng)基相當［9］。因此在培養(yǎng)的過程中，我們首先采用差速貼壁法初步去除成纖維細胞，然后以B27添加劑結合低濃度血清調整的方法對AST進行純化。

體外培養(yǎng)的成纖維細胞及AST對血清均有明顯的生長依賴性，而培養(yǎng)早期成纖維細胞對血清的依賴性更強［10］。因此，根據(jù)這兩種細胞自身的增殖特點和對血清的依賴性生長特性及時調整血清濃度十分關鍵。研究證實在10ml／L血清濃度下體外培養(yǎng)的AST，7～9d進入增殖期，而成纖維細胞2～3d即進入對數(shù)生長期。但在2.5ml／L血清濃度時，成纖維細胞生長速度則明顯下降［11］。本實驗細胞接種時采用10ml／L血清濃度旨在提高接種細胞的成活率。當培養(yǎng)至第3天時將血清濃度降至2.5ml／L，在此血清濃度下成纖維細胞由于缺乏營養(yǎng)而不能大量增殖，此時AST在B27添加劑以及少量血清的作用下得以存活。待細胞培養(yǎng)至第9天，即AST進入生長高峰期時提高血清濃度至5ml／L，此血清濃度尚不足以引起成纖維細胞的大量增殖，而AST在B27添加劑的共同作用下分裂增殖明顯增加。待AST增殖鋪滿培養(yǎng)瓶底部時，由于AST高密度對成纖維細胞增殖也有一定的抑制作用從而獲得純度較高的AST。

本研究為體外深入研究成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)AST的神經(jīng)干細胞生物學特性、探索中樞神經(jīng)干細胞來源、分布以及以后臨床應用提供了參考，為成熟后神經(jīng)重塑機制的研究提供了實驗依據(jù)。

［1］ Emsley JG，Arlotta P，Macklis JD.Star－cross’d neurons astrogenlial effects on neural repair in the adult mammalian CNS［J］.Trends N Eurosci，2004，27（5）：238－240.

［2］ Andrea V，Jacopo M.Astrocytes from brain glue to communication elements：the revolution continues ［J］.Nature Reviews Neuroscience，2005，6（8）：626－640.

［3］ Carmignoto G，F(xiàn)ellin T.Glutamate release from astrocytes as a non－synaptic mechanism for neuronal synchronization in the hippocampus［J］.Physiol Paris，2006，99（2～3）：98－102.

［4］ Seri B，Garcia－Verdugo JM，Alvarez－Buylla A，et al.Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus［J］.J Neurosci，2001，21（18）：7153－7160.

［5］ Laywell ED，Rakic P，Kukekov VG，et al.Identification of a multipotent astrocytic stem cell in the immature and adult mouse brain［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（25）：13883–13888.

［6］ Tetsuya I，Ichiro N，Michael S，et al.Phenotypic and functional heterogeneity of GFAP－expressing cells in vitro：Differential expression of LeXCD15by GFAP－expressing multipotent neural stem cells and non－neurogenic astrocytes［J］.Glia，2006，53（3）：277－293.

［7］ Carlos L，Arturo AB.Proliferation subventricular zone cells in the adult mammalian forebrain can differentiate into neuron and glia［J］.Roc Natl Acad Sci USA，1993，90（5）：2074－2077.

［8］ Nash HH，Borke RC，Anders JJ.New method of purification for establishing primary cltures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb［J］.Glia，2001，34（1）：81－87.

［9］ Brewer GJ，Torricelli JR，Evege EK，et al.Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B－27Supplemented NEUROBASALTM.A new serum－free medium combination［J］.J Neurosci Res，1993，35（5）：567－576.

［10］ Kaufman LM，Barrett JN.Serum factor supporting long－term survival of rat central neurons in culture［J］.Science，1983，220（4604）：1394－1396.

［11］ Komiyama T，Nakao Y，Toyama Y，et al.A novel technique to isolate adult Schwann Cells for an artificial nerve conduit［J］.Neurosci Methods，2003，122（2）：195－200.