孫明飛，宋言崢，張雙林＊，董彥軍，楊忠信

（1.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胸心血管外科，河南 開封 475000；2.復(fù)旦大學(xué) 附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 200540）

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率 占所有新發(fā)惡性腫瘤患者的12.6%，死亡率占惡性腫瘤的17.8%，且逐年呈上升趨勢［1］。近些年來，肺腺癌的發(fā)病率明顯增長，約占發(fā)病率較高的肺鱗狀細(xì)胞癌的30%～40%［2］。因此，研究肺腺癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷及治療方法已成為腫瘤學(xué)研究的迫切任務(wù)。目前臨床中主要的診斷方法有影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室生化檢查、病理學(xué)等手段，但仍然有很大一部肺腺癌不能早期明確。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于各種疾病及同一疾病不同層面的研究。它能直接從蛋白質(zhì)水平入手，尋找與疾病相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)，為多種疾病的發(fā)病機(jī)制研究及早期臨床診斷提供依據(jù)。我們利用成熟的雙向電泳技術(shù)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI－TOF－MS）技術(shù)，建立穩(wěn)定的比較蛋白組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，從而獲得肺腺癌雙向凝膠電泳圖譜并初步篩選及鑒定肺腺癌相關(guān)蛋白，為尋找肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中特異性的腫瘤標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

手術(shù)切除的新鮮肺腺癌組織及同一患者配對(duì)癌旁組織標(biāo)本18例，取自河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)診斷為肺腺癌。IPG預(yù)制膠條（pH3～10，18cm），尿素，硫脲，三丁基膦，二硫蘇糖醇，苯甲磺酰氟（BioRad公司），三氟乙酸、乙腈、碘乙酰銨（Sigma公司），clean－up試劑盒、銀染試劑盒、兩性電解質(zhì)、低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)（Amersham Pharmacia Biotech公司），Ettan IPGphor等電聚焦儀、Hofer SE 600、UMax Powerlook 2110XL 掃描儀及 ImageMaster 2DPlatinum 5.0圖像分析軟件（GE Amersham公司），分光光度儀（P－2000，Hitachi公司），純水裝置（Millpore公司），冷卻水循環(huán)系統(tǒng)（用于電泳冷卻，Cole－Parmer公司），超聲細(xì)胞破碎儀（國產(chǎn)）。

1.2 組織標(biāo)本收集及處理

刮取手術(shù)切除后新鮮的肺腺癌組織及距腫瘤5cm以上的癌旁組織，刮取時(shí)盡可能的去除可辨別的間質(zhì)成分，以得到較純凈的腫瘤細(xì)胞和癌旁肺組織細(xì)胞。在低溫狀態(tài)下將取得的標(biāo)本用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗，以去除血液成分。處理后的樣品置于－80℃冰箱保存。

1.3 樣品制備

分別取肺腺癌組織和癌旁組織80mg，液氮研磨后，加入適量全細(xì)胞裂解液，用勻漿器勻漿后，進(jìn)行冰浴超聲裂解。離心14000r／min，40min，4℃，取上清。蛋白定量用Bradford試劑盒（詳見操作指南書），100ug樣品分裝置于－80℃冰箱保存。

1.4 雙向電泳

第一向等電聚焦電泳（IEF）主要根據(jù)IPGphor等電聚焦系統(tǒng)指南和Gorg等［3］的方法并根據(jù)樣品適當(dāng)情況改進(jìn)，程序設(shè)置如下：30v12hrs，500v1hr，1000v1hr，8000v8hrs，500v4hrs。等電聚焦結(jié)束后，將IPG膠條進(jìn)行兩次平衡，后將平衡好的IPG膠條轉(zhuǎn)移至12.5%的分離膠的上端，進(jìn)行第二項(xiàng)電泳（SDS－PAGE），電泳設(shè)置條件如下：恒流15mA 30min；恒流30mA至溴酚藍(lán)離膠下沿0.5cm。電泳所得的凝膠按照蛋白質(zhì)銀染試劑盒的操作指南進(jìn)行銀染。

1.5 掃描及圖像分析

所得圖譜借助每UMax Powerlook 2110XL掃描儀對(duì)電泳后的膠圖分別進(jìn)行掃描，所得掃描圖像輸入計(jì)算機(jī)，采用ImageMaster 2DPlatinum 5.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行背景消減、蛋白質(zhì)點(diǎn)檢測和校正，獲取蛋白質(zhì)點(diǎn)的位置坐標(biāo)和表達(dá)量等分析，將表達(dá)量差異達(dá)3倍及以上者視為差異蛋白。

1.6 膠內(nèi)酶解及 MALDI－TOF－MS鑒定

將掃描分析后的膠置于明亮的燈光下，用硅烷化的槍頭切取蛋白點(diǎn)，用2mg／L胰蛋白酶膠內(nèi)酶解蛋白，得到樣品后由中科院上海生化所蛋白質(zhì)組中心協(xié)助完成MALDI－TOF－MS，獲得檢測樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜。

1.7 數(shù)據(jù)庫檢索

獲得檢測樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜，根據(jù)各肽段的m／z數(shù)據(jù)，利用 Mascot和Profound軟件，設(shè)置適當(dāng)?shù)乃阉鲄?shù)，在NCB Inr，Swis－sprot蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索理論上酶解肽段能與之相匹配的蛋白，根據(jù)搜索結(jié)果并結(jié)合蛋白質(zhì)在膠上的等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量最終確定蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織與癌旁組織的雙向電泳圖譜建立

相同的條件下，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次雙向電泳，獲得了重復(fù)性較好的肺腺癌組織及癌旁組織的雙向凝膠電泳銀染圖譜（見圖1）。經(jīng)ImageMaster 2DPlat inum 5.0軟件分析肺腺癌組織及癌旁組織的雙向凝膠電泳銀染圖譜的平均蛋白點(diǎn)數(shù)分別為1232±56和1158±71。

圖1 雙向凝膠電泳銀染圖譜

2.2 肺腺癌組織和癌旁組織蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜分析

蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜經(jīng)軟件分析，獲得差異大于3倍的蛋白點(diǎn)63個(gè)，12個(gè)點(diǎn)僅在肺腺癌組織中表達(dá)，5個(gè)點(diǎn)僅在配對(duì)癌旁組織中表達(dá)，其中部分蛋白質(zhì)點(diǎn)放大圖譜（見圖2）。

圖2 癌及癌旁組織蛋白質(zhì)組部分差異蛋白點(diǎn)放大圖

2.3 質(zhì)譜分析

我們挖取僅在肺腺癌組織高表達(dá)的12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，11個(gè)蛋白點(diǎn)被成功鑒定?？鄢哂?，實(shí)際鑒定出5種蛋白質(zhì)（見表1），其中4種與腫瘤相關(guān)，分別為S100鈣結(jié)合蛋白、Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab－14、微管輔助蛋白、凝溶膠蛋白。

表1 所鑒定的差異表達(dá)蛋白

3 討論

近幾年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用腫瘤標(biāo)志物的篩選?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)一批有價(jià)值的潛在標(biāo)志物，為疾病的早期診斷和治療開辟了新的途徑。蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究內(nèi)容包括：表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)、功能蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)，最大的優(yōu)勢是可以在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中觀察一個(gè)完整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞型在特定的時(shí)間下，生理或病理狀態(tài)中所發(fā)生的相應(yīng)的變化［4］。

我們選取肺腺癌組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)材料主要考慮到以下兩個(gè)問題：一是肺腺癌細(xì)胞系的體外培養(yǎng)環(huán)境與人體內(nèi)環(huán)境的差異，將會(huì)導(dǎo)致其蛋白表達(dá)的差異。二是肺腺癌血清中含有較多的高豐度蛋白，如：白蛋白、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。雖然去除高豐度蛋白的方法很多，但都易去除腫瘤組織表達(dá)的低豐度蛋白。為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為客觀，我們?nèi)?biāo)本時(shí)盡可能地從腫瘤組織刮取腫瘤細(xì)胞并去除可以辨別的間質(zhì)成分，在低溫下用無菌生理鹽水進(jìn)行反復(fù)清洗以去除血液成分，然后利用雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)肺腺癌組織，同一患者配對(duì)癌旁組織蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜的差異進(jìn)行研究分析。最終，我們建立了分辨率高且重復(fù)性好的人肺腺癌組織蛋白的雙向凝膠電泳圖譜，并鑒定出了5個(gè)獨(dú)特的蛋白質(zhì)點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5個(gè)獨(dú)特的蛋白點(diǎn)均在肺腺癌組織中高表達(dá)，其中23KD－白蛋白是未能完全去除血液成分污染所致。經(jīng)查文獻(xiàn)，凝溶膠蛋白、S100鈣結(jié)合蛋白、Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab－14、微管輔助蛋白均有腫瘤相關(guān)性，這些蛋白對(duì)尋找肺腺癌特異性腫瘤標(biāo)志物具有重要意義，它們的生物學(xué)功能及文獻(xiàn)報(bào)道情況簡述如下。

鈣結(jié)合微管蛋白（gelsolin）的生物學(xué)功能與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及保持細(xì)胞骨架的完整性有關(guān)。研究報(bào)道［5］，鈣結(jié)合微管蛋白高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者生存率明顯降低，可能與該蛋白潛在增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。S100鈣結(jié)合蛋白（S100－A11）屬于S100家族成員之一，具有多種生物學(xué)功能，主要參與轉(zhuǎn)導(dǎo)鈣依賴性的細(xì)胞調(diào)節(jié)信號(hào)、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期活動(dòng)、腫瘤的形成及進(jìn)展有關(guān)［6］。相關(guān)研究［7］表明，S100－A11在多種腫瘤中異常表達(dá)，例如S100－A11在胃癌、食管癌、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌中的表達(dá)陽性率分別為60%、70%、40%、50%、80%、50%。Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab－14對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、分泌等都有重要作用，可能參與了肺腺癌細(xì)胞惡性生長、去分化和其他表型與生物學(xué)特征改變的調(diào)節(jié)與控制。微管輔助蛋白（Stathmin）是近年來發(fā)現(xiàn)的，序列上高度保守，其生物學(xué)功能與細(xì)胞的增殖、分化有密切關(guān)系。Rubin等［8］報(bào)道細(xì)胞內(nèi)外有多種癌基因、抑癌基因及細(xì)胞因子表達(dá)的產(chǎn)物直接或間接與Stathmin蛋白作用。Stathmin的高表達(dá)可在多種腫瘤中檢測到，如惡性嗜鉻細(xì)胞瘤［9］、乳腺癌［10］、卵巢癌［11］等，但尚未見在肺腺癌中報(bào)道。

這些蛋白在肺腺癌組織中高表達(dá)，說明它們?cè)诜蜗侔┑陌l(fā)生、發(fā)展中起到了相應(yīng)的功能，但是否能作為肺腺癌的特異性腫瘤標(biāo)志物，有待于我們?cè)诖髽颖局羞M(jìn)一步驗(yàn)證，其具體功能也值得我們進(jìn)一步深入研究。

［1］Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Global cancer statistics［J］.2002CA Cancer J Clin，2005，55（2）：74－108.

［2］Crocetti E，Paci E.Trends in lung adenocarcinoma incidence and survival［J］.lung cancer，2002，35（2）：215－216.

［3］Gorg A，Obemaier C，Boguth G，et al，The current state of two－dimensional electrophoresis with im－mobilized pH gradients［J］.Electrophoresis，2000，21：1037－1039.

［4］Chao TC，Hansmeier N，Halden RU，Towards proteome standards：the use of absolute quantitation in highthroughput biomarker discovery［J］.Proteomics，2010，73（8）：1641－1646.

［5］Yang J，Tan DF，Asch HL，et al.Prognostic significance of gelsolin expression level and variability in non－small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2004，46（1）：29－42.

［6］Ruse M，Lambert A，Robinson N，et al.S100A7，S100A10，and S100A11are transglutaminase sub－strates［J］.Biochemistry，2001，40（10）：3167－3173.

［7］唐光華，倪潤洲，肖明兵，等.鈣囊素及半乳凝素23在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.江蘇醫(yī)藥，2010，36（2），136－139.

［8］Rubin CI，Atweh GF.The role of stathmin in the regulation of the cell cycle［J］.Cell Biochem ，2004，93（2）：242－250.

［9］Sadow PM，Rumilla KM，Erickson LA，et al1Stathmin expression in pheochromocytomas，paragangliomas，and in other endocrine tumors［J］.Endocr Pathol，2008，19（2）：97－103.

［10］McGrogan BT，Gilmartin B，Carney DN，et al.Taxanes，microtubules and chemoresistant breast cancer［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1785（2）：96－132.

［11］Su D，Smith SM，Preti M，et al1Stathmin and tubulin expression and survival of ovarian cancer patients receiving platinum treatment with and without paclitaxel［J］.Cancer，2009，115（11）：2453－2463.