張翼飛

（哈藥集團(tuán)制藥總廠 黑龍江 哈爾濱 150086）

在青霉素G發(fā)酵生產(chǎn)菌種的制備過程中，菌種誘變篩選往往由于細(xì)胞壁的存在而影響其對外界理化因子的敏感性，因而我們采用細(xì)胞脫壁后再進(jìn)行紫外線誘變處理的方法，選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種，大大提高了菌種細(xì)胞的變異率，加快了高產(chǎn)特性菌株的篩選過程，實踐證明該方法是行之有效的。

1 實驗材料

1.1 菌株

產(chǎn)黃青霉菌618#

1.2 培養(yǎng)基[2]

（1）斜面培養(yǎng)基（%）

甘油 0.75；甘油蜜糖 0.75；酵母浸處粉 0.5；NaCL 1;Ca-SO40.025;部分微量元素；瓊脂 2.7；pH 6.8

（2）菌絲培養(yǎng)基（%）

玉米漿 6.1；蔗糖 2.0；CaCO30.5（調(diào) PH 后加入）；pH 5.8

（3）再生培養(yǎng)基（%）

NaNO30.3;MgSO4·7H2O 0.05;FeSO4·7H2O 0.001;KCL 0.05;KH2PO40.1;

葡萄糖 4；酵母膏 0.2；瓊脂 2.7；pH 6.8（用穩(wěn)定劑配制）

（4）穩(wěn)定劑

0.7 M NaCL

（5）種瓶培養(yǎng)基

以蔗糖、玉米漿為主要碳、氮源，pH5.8

（6）發(fā)酵瓶培養(yǎng)基

以乳糖、玉米漿為主要碳、氮源，加無機(jī)鹽類組成，pH5.9

1.3 酶

纖維素酶+cellulase R—10

2 實驗方法

2.1 原生質(zhì)體的制備

（1）菌體培養(yǎng)

將618#菌種新鮮斜面加入適量無菌水，刮下菌株孢子制成孢子懸液，經(jīng)玻璃珠打散過濾后取1mL接種于40mL的菌絲培養(yǎng)液中，28℃，240rpm條件下培養(yǎng)36h，得到菌絲體。

（2）胞壁酶處理

用4層無菌紗布過濾收集菌絲體，無菌水洗2-3次，再用穩(wěn)定劑洗兩次，取1g左右的菌絲體懸浮于5mL穩(wěn)定劑中，加入5mg纖維素酶和5mg cellulase R-10，30℃恒溫水浴振蕩搖床60rpm，1.5-2h，鏡檢有大量原生質(zhì)體釋放后，用200目尼絨網(wǎng)濾除菌絲碎片和未酶解的菌絲體，濾液經(jīng)1000rpm離心5min，棄上清，加10mL穩(wěn)定劑重復(fù)離心兩次，加入5mL穩(wěn)定劑懸浮原生質(zhì)體，備用。

2.2 紫外線誘變處理原生質(zhì)體

取原生質(zhì)體懸浮液適量，進(jìn)行紫外線（253.7nm）誘變處理，分別照射 25′′和 40′′。

2.3 高產(chǎn)菌株的檢出

將處理后的原生質(zhì)體懸浮液涂于再生培養(yǎng)基平皿中，t=25℃，Φ=45±5%，恒溫培養(yǎng)7天。帶菌落長出后，挑選結(jié)構(gòu)緊密，形狀規(guī)則的單菌落傳斜面培養(yǎng)后，進(jìn)行發(fā)酵搖瓶的篩選。

3 實驗結(jié)果

3.1 紫外線對原生質(zhì)體的致死作用

我們對產(chǎn)黃青霉菌618#進(jìn)行了紫外線處理，并分別采用25′、40′的計量處理原生質(zhì)體，由表1可以看出，隨著照射時間的增加，致死率也相應(yīng)提高。

表1 致死率

3.2 發(fā)酵相對效價與相對產(chǎn)量的變化

經(jīng)搖瓶發(fā)酵篩選得到701#菌種，該菌種在發(fā)酵效價與總產(chǎn)量方面均高于出發(fā)菌株618#（表2）。

表2 兩菌株發(fā)酵相對效價及相對產(chǎn)量

3.3 限氧條件下的搖瓶考查

用改變瓶口紗布層數(shù)來改變供氧的方法考查76#菌株在限氧條件下發(fā)酵效價的變化情況（表 3）。

由表3可以看出，隨著紗布層數(shù)的增加、供氧量的減少，701#菌株的發(fā)酵效價變化不大。

表3 不同限氧條件下發(fā)酵效價變化

3.4 單位菌絲合成能力的比較

單位菌絲合成能力的比較是考查一個新菌株是否有推廣生產(chǎn)價值的主要參數(shù)之一，為此我們將菌株701#和菌株618#進(jìn)行了對比考查（表4）。

表4 兩菌株單位菌絲合成能力比較

從表3可以看出701#菌株單位菌絲的青霉素合成能力明顯高于618#菌株。

3.5 穩(wěn)定性考查

將701#菌株傳代后，進(jìn)行搖瓶考查，結(jié)果表明其F1代、F2代、F3代發(fā)酵效價與總產(chǎn)量均無明顯變化，說明該菌株的穩(wěn)定性較好。

4 討論

本試驗采用的方法篩選青霉素高產(chǎn)菌株，試驗證明，產(chǎn)黃青霉菌的細(xì)胞壁被去除后，對紫外線的敏感度增強(qiáng)，隨著照射時間的增加，致死率相應(yīng)提高，在引起絕大多數(shù)原生質(zhì)體致死的同時，存活個體中的變異頻率大大提高，處于對數(shù)生長期的菌絲體最容易酶解，通過搖瓶篩選我們得到701#菌株，該菌株除發(fā)酵效價和總產(chǎn)量有所提高外，對氧的需求也有所降低，取得了很好的效果。

［1］熊宗貴.發(fā)酵工藝與原理[M].中國科學(xué)技術(shù)出版社.

［2］翁艷軍.青霉素產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體融合[J].中國抗生素雜志，2003，3：129-130.