張敏妍 張 明

(1.中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學生物醫(yī)學工程系 陜西 西安 710032；2.西安理工大學 陜西 西安 710048)

去污劑是一種能在水中形成微囊的雙親性小分子，這種微囊可以與脂雙層發(fā)生相互作用形成磷脂和去污劑混合的微囊，或者是蛋白質(zhì)、去污劑以及磷脂混合的微囊，它們是以磷脂—去污劑—蛋白質(zhì)或者是去污劑—蛋白質(zhì)混合物的形式存在于水溶液中[1]。非離子型去污劑Trtion X-100已經(jīng)廣泛地應用于不同的學科領域，人們對Trtion X-100與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)之間的相互作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)Trtion X-100促使了脂質(zhì)混合物中脂筏結(jié)構(gòu)的形成并且會誘使脂筏微區(qū)內(nèi)的相態(tài)發(fā)生改變[2-3]。Trtion X-100作為阻斷緩沖液時，它的疏水結(jié)構(gòu)域的存在使得整合蛋白和膜的結(jié)合非常緊密，溶解下來的膜蛋白能夠保持較強的活性，并且通過透析可以容易地除去去污劑，在脂筏拆離的實驗[4]中它已經(jīng)成為人們首選的非離子去污劑。我們對Triton X-100的濃度以及孵育液/膜溶液的體積比（Vi/Vm）進行了研究，得出了最佳的體積比、濃度。用原子力顯微鏡對蛋白含量最高組分進行了觀察，鑒定出其蛋白質(zhì)主要成分為脂筏蛋白。實驗結(jié)果對于迅速、高效的分離脂筏蛋白質(zhì)提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

血液樣品由陜西省血液中心提供。Tris、TritonX-100、牛血清蛋白（BSA）購買于 Sigma公司，PMSF、考馬斯亮藍 G-250 購買于 Aldrich 公司，甘油、蔗糖、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4等其他試劑均為國產(chǎn)的分析純。水為離子交換、二次蒸餾水。原子力顯微鏡，高速離心機，超速離心機，紫外分光光度計等。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅細胞膜的制備

紅細胞膜的制備按照文獻[5]方法并做了適當?shù)母倪M，取10mL新鮮A型血液置入含有肝素抗凝劑的離心管中，離心20min（870×g，4℃），移棄上層液及紅細胞表層的絨毛狀沉淀。紅細胞用3倍量預冷的PBS等滲緩沖液 （150mM/L NaCl，5mM/L 磷酸鹽，pH 7.4）重懸，離心 15min（2400×g，4℃），除去上清液及沉淀表層，重復洗滌3次。洗凈的紅細胞用4體積預冷的濃度為10mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）重懸，4℃靜置 2h，完全溶血。 離心 15min（7900×g，4℃），沉淀用濃度為10mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）重懸，重復離心和重懸四次，直至得到乳白色的絮狀沉淀，沉淀4℃儲存。

1.2.2 脂筏成分的萃取

在4℃條件下，用PBS溶液對膜溶液進行孵育，然后與蔗糖溶液混合，蔗糖最終濃度為40%（m/v），取0.6mL混合液于離心管底部，依次鋪置1.8mL 30%蔗糖溶液，1.2mL 5%蔗糖溶液，離心 18h（230，000×g，4℃），從上層開始以 400μL 為單元分別抽取分離的膜片段，共為9個組分，離心10min（15000×g，4℃），4℃儲存。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍染色法（Bradford法）測定蛋白質(zhì)含量[6]，配制濃度為1mg/mL的牛血清蛋白溶液為標準液，繪制標準曲線，然后對樣品進行測定，由標準曲線計算得出1.2.2中離心得到的各組分中的蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 原子力顯微鏡的觀察

將1.2.3中檢測得出的蛋白含量最高的組分用去離子雙蒸水稀釋1000倍，取4μL滴在新剝離的云母片上，空氣中干燥，樣品被置于原子力顯微鏡上測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 孵育液/膜溶液的體積比的影響

孵育液 PBS（200μg/mL PMSF， 1%（v/v）Triton X-100）與膜溶液的體積比分別為 1：1、2：1、3：1，4℃靜置 30min，然后重新與 PBS 溶液（60%（m/v）蔗糖，1.0%Triton X-100）混合，蔗糖最終濃度為40%，注射器抽提混合，離心，檢測各組分中蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如圖1所示。當Vi/Vm＝3:1時第6組分的蛋白質(zhì)含量最高；當Vi/Vm＝4:1時蛋白質(zhì)含量最大值出現(xiàn)在第7組分中，最大值的位置發(fā)生變化。由此可見，在萃取過程中存在著其他膜蛋白微量損失的現(xiàn)象，并且當孵育液/膜溶液的體積比值較大（Vi/Vm＝4:1）時脂筏蛋白質(zhì)存在的組分位置發(fā)生改變。

圖1 在孵育液/膜溶液不同體積比時各組分蛋白質(zhì)含量

2.2 Triton X-100的濃度的影響

孵育液 PBS （200μg/mL PMSF，0.5%、1.0%、2.0%Triton X-100） 與膜溶液的體積比為 3：1，4℃靜置 30min， 重新與PBS（60%蔗糖，0.5%、1.0%、2.0%Triton X-100）溶液混合，蔗糖最終濃度為40%，注射器抽提混合，離心，檢測各組分中蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如圖2所示。蛋白質(zhì)含量最高的組分出現(xiàn)在Triton X-100的濃度為1.0%時，當濃度為0.5%時蛋白質(zhì)含量最大值明顯小于其他兩種條件下的含量，1.0%時的含量最大值約是0.5%時含量最大值的3倍。這說明隨著去污劑濃度的增加，由抗去污劑拆離的去污劑—蛋白質(zhì)的混合物出現(xiàn)一個最大值。濃度由1%變?yōu)?%時，蛋白質(zhì)含量最大值的變化不大，這說明去污劑濃度達到一定值時，濃度的變化對萃取蛋白數(shù)量影響不大，所以萃取抗去污劑脂筏結(jié)構(gòu)時，選擇Triton X-100的濃度為1%為最佳值。

2.3 AFM觀察

本實驗中取100μL離心得到的蛋白質(zhì)含量最高的組分，用去離子水稀釋1000倍，吸取5μL稀釋液滴于新剝離的云母片上，置于原子力顯微鏡上進行測試，結(jié)果如圖3所示。由圖3（A）可見，當脂筏成分稀釋到一定倍數(shù)時以單個囊泡的形式存在于基片上，并且輪廓清晰，囊泡大小較為均一。圖3（B）中顯示的是（A）中囊泡的三維立體形貌，由圖可見是一些分散的橢球狀的囊泡，高度約為60nm左右，由此可以得出上述中的蛋白質(zhì)含量最高的組分其中的蛋白質(zhì)主要以脂筏蛋白的形式存在。

圖3 抗去污劑膜片段稀釋1000倍的原子力顯微鏡圖像

3 結(jié)論

在抗去污劑膜蛋白拆離的過程中，孵育液/膜溶液的體積比、Triton X-100的濃度、孵育時間對不同組分中抗去污劑膜蛋白含量以及膜總蛋白平均的含量存在著不同的影響：（1）孵育液/膜溶液體積比值為3：1時，第6組分中的脂筏蛋白質(zhì)含量最高，當體積比值較大時（Vi/Vm＝4：1）脂筏蛋白質(zhì)最高組分的位置發(fā)生變化（圖1）；（2）脂筏蛋白質(zhì)的含量隨Triton X-100濃度變化會出現(xiàn)一個最大值（圖2），證實了Triton X-100濃度為1%時為最佳值。用原子力顯微鏡對蛋白質(zhì)最高的組分進行觀察，顆粒尺寸大小在50－100nm左右，從而證實了其主要成分為脂筏蛋白質(zhì)。實驗中較為詳盡的研究了不同的因素對抗去污劑膜蛋白拆離的影響，得出了影響因素的最佳值，其實驗結(jié)果對于迅速、高效的分離脂筏蛋白質(zhì)提供了一定的參考依據(jù)。

［1］Zhang H M， Kurisu G J， Smith J L， Cramer W A.A defined protein-detergent-lipid complex for crystallization of integral mem brane proteins：The cytochrome b6f complex of oxygenic photosynthesis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（9）：5160-5163.

［2］張宏煒，孫遜，張志榮.載基因納米脂質(zhì)體的制備及有關性質(zhì)的初步研究[J].四川大學學報：醫(yī)學版，2006，37（2）：298-300.

［3］Go?i F M， Urbaneja M A， Arrondo J L， Alonso A， Durrani A A，Chapman D.The interaction of phosphatidylcholine bilayers with Triton X-100[J].Eur J Biochem，1986，160：659-665.

［4］Schwab W， Galbiati F， Volonte D， Hempel U， Wenzel K W，F(xiàn)unk R H，Lisanti M P，Kasper M.Characterisation of caveolins from cartilage：expression of caveolin-1，-2 and-3 in chondrocytes and in alginate cell culture of the rat tibia[J].Histochem Cell Biol，112：41-49.

［5］Dodge J T， Mitchell C， Hanahan D J.The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes[J].Arch Biochem Biophys，1963，100：119-130.

［6］李琳，焦新之.應用蛋白染色劑考馬斯藍G-250測定蛋白質(zhì)的方法[J].植物生理學通訊，1980，6：52-54.