王 琪 嚴(yán)善春 金 虎 王艷軍

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)(內(nèi)蒙古克什克騰旗林業(yè)局森防站)

誘導(dǎo)防御機(jī)制在植物自我保護(hù)中發(fā)揮著重要作用［1］，植物遭受損傷或昆蟲取食后，會誘導(dǎo)防御酶表達(dá)，促使植物產(chǎn)生大量抗性相關(guān)物質(zhì)。多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物體內(nèi)2種重要的防御酶，它們常被作為植物產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性的指示性物質(zhì)［2-5］。PPO是一類由核基因編碼的含銅金屬蛋白酶，能夠催化一元酚的O-羥基化形成O-二元酚，O-二元酚氧化形成O-二醌。醌是高效的反應(yīng)中間體，可以迅速聚合成為黑色素或褐色素，影響植物營養(yǎng)價(jià)值。在許多植物中，PPO定位于質(zhì)體內(nèi)囊體，它的底物一元酚或O-二元酚定位在液泡，正常情況下二者是分離的，當(dāng)植物受機(jī)械損傷、動物啃食、昆蟲噬咬、病原菌入侵時(shí)，這種空間隔離將被打破，PPO表現(xiàn)出酶活性［6-9］。在酸性條件下(pH＜4)，醌會經(jīng)受反歧化反應(yīng)形成半醌活性物質(zhì)，導(dǎo)致活性氧(ROS)的產(chǎn)生。當(dāng)pH較高時(shí)，醌的親核加成反應(yīng)會形成黑或褐色素，同時(shí)醌的共價(jià)加成也會伴隨發(fā)生，形成的細(xì)胞親核物質(zhì)會與昆蟲消化蛋白結(jié)合［10］。這些次生反應(yīng)會破壞昆蟲DNA、蛋白、油脂［11］。PAL是僅存在于植物和部分微生物體內(nèi)的酶類。PAL催化L-苯丙氨酸經(jīng)由非氧化脫氨反應(yīng)，生成反式肉桂酸和氨，是苯丙烷代謝的首步反應(yīng)。由此進(jìn)入植物的次級代謝，可以生成香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中間產(chǎn)物，這些化合物進(jìn)一步可轉(zhuǎn)化為香豆素、綠原酸，也可以形成苯丙烷酸CoA酯，再進(jìn)一步代謝轉(zhuǎn)化為一系列苯丙素類化合物，如黃酮、木質(zhì)素、生物堿等。木質(zhì)素的形成，可以增加細(xì)胞壁的厚度，增加組織木質(zhì)化程度，形成昆蟲取食的機(jī)械障礙［12］。因此PAL活性可以作為檢驗(yàn)植物是否產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性的指標(biāo)，同樣也是評價(jià)植物抗逆境能力的一個生理指標(biāo)［13-14］。2種防御酶活性的變化與植物抗蟲性密切相關(guān)［5，9］。筆者研究剪葉或昆蟲取食后，興安落葉松體內(nèi)PAL和PPO的活性變化，探討興安落葉松體內(nèi)防御酶活性與誘導(dǎo)因子的關(guān)系，為林木誘導(dǎo)抗性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

植物材料為東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實(shí)驗(yàn)林場老山試驗(yàn)站網(wǎng)棚內(nèi)培育的5年生興安落葉松，苗高(100.0±20.0)cm，當(dāng)年生枝條16～18枝。昆蟲材料為采自林間的落葉松毛蟲(Dendrolimus superans)蛹，室內(nèi)羽化，交配產(chǎn)卵，幼蟲孵化后，飼養(yǎng)至3齡備用。

1.2 試驗(yàn)方法

局部剪葉損傷誘導(dǎo):試驗(yàn)分為剪葉4枝、剪葉8枝和剪葉12枝3種處理，分別在苗的東、南、西、北4個方向各選擇1、2、3個枝條，對所選枝條進(jìn)行剪葉處理。每種處理又分為25%、50%和75%3種不同剪葉程度，具體剪葉方法參照徐偉［15］。在剪葉處理后的0.5、6.0、12.0、24.0、72.0、120.0 h 取樣株上未損傷的剩余針葉，裝入拉鏈塑料袋內(nèi)，迅速放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室冷凍保存。所有處理每個采樣時(shí)間均設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)均處理3株樣樹。

幼蟲取食損傷誘導(dǎo):在健康苗木的東、南、西、北4個方向各選擇1個枝條，將一定數(shù)量的3齡幼蟲放至所選枝條上，罩上紗籠，當(dāng)取食量相當(dāng)于剪葉25%、50%和75%時(shí)，將幼蟲取下，并分別在處理后的0.5、6.0、12.0、24.0、72.0、120.0 h 取樣株上未損傷的剩余針葉，裝入拉鏈塑料袋內(nèi)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室冷凍保存。所有處理每個采樣時(shí)間均設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)均處理3株樣樹。

防御酶活性測定:PPO活性測定參照Stout等［3］，以△OD470 nm 處吸光度變化0.01為1個酶活力單位。PAL活性測定參照 Liu等［16］，以△OD290 nm處吸光度變化0.01為1個酶活力單位。蛋白質(zhì)含量測定參照Bradford方法［17］，以牛血清蛋白(SIGMA公司)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

數(shù)據(jù)分析:使用 SPSS 12.0軟件，統(tǒng)計(jì) PAL、PPO活性的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差后，采用one-way ANOVA差異顯著性分析，以LSD(最小顯著法)在0.05和0.01水平下檢驗(yàn)與對照之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 剪葉損傷對松針葉PPO和PAL的系統(tǒng)誘導(dǎo)

2.1.1 損傷對松針葉PPO活性的系統(tǒng)誘導(dǎo)

從表1可見，不同程度剪葉處理后，興安落葉松未損傷部分針葉內(nèi)PPO的活性均被迅速強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在處理后6 h達(dá)到峰值，極顯著高于對照，之后PPO活性迅速下降。在24 h時(shí)，除4枝50%外，其它損傷程度誘導(dǎo)的PPO活性均迅速下降，在72～120 h酶的活性無顯著變化。剪葉4枝50%誘導(dǎo)的PPO活性最強(qiáng)，且酶活性的持續(xù)時(shí)間較長。

表1 落葉松毛蟲取食和剪葉程度不同的興安落葉松針葉PPO活性 U·mg-1

2.1.2 損傷對松針葉PAL活性系統(tǒng)誘導(dǎo)

不同程度剪葉損傷處理后，興安落葉松剩余完好針葉內(nèi)PAL的活性隨時(shí)間變化顯著。剪葉4枝25%時(shí)，PAL的活性在24～120 h被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，且與對照差異極顯著;剪4枝50%、75%誘導(dǎo)的PAL活性高于25%，在處理后的0.5～120 h與對照差異顯著或極顯著。在損傷后24～120 h，剪葉8枝25%誘導(dǎo)的PAL活性迅速增加，與對照差異極顯著;8枝50%、75%誘導(dǎo)的PAL活性在6～120 h與對照差異極顯著。剪葉處理后的0.5～72.0 h，12枝25%誘導(dǎo)的PAL活性高于50%、75%，且在損傷后6 h即與對照差異顯著;50%、75%在損傷后24～72 h被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，并與對照差異極顯著。剪葉4枝50%誘導(dǎo)的PAL活性較其它剪葉處理程度的反應(yīng)更加迅速，且活性最高。

2.2 松毛蟲取食對松針葉PPO和PAL的系統(tǒng)誘導(dǎo)

松毛蟲取食后0.5～24.0 h，PPO活性極顯著高于對照。與剪葉相比，昆蟲取食誘導(dǎo)的PPO活性更高，且持續(xù)時(shí)間更長(表1)。取食4枝25%、75%誘導(dǎo)的PPO活性，在處理后0.5～72.0 h顯著高于相同損傷程度剪葉誘導(dǎo)，取食4枝50%誘導(dǎo)的PPO活性，在6～72 h顯著高于剪葉4枝50%誘導(dǎo)，且取食4枝50%誘導(dǎo)的酶活性較其它取食程度高。此外，發(fā)現(xiàn)昆蟲取食誘導(dǎo)PPO活性的反應(yīng)速度與剪葉誘導(dǎo)無顯著差異，酶活性的變化趨勢相同。

松毛蟲取食誘導(dǎo)PAL活性的變化趨勢與剪葉誘導(dǎo)相同，均在處理后72 h表現(xiàn)出較高的活性，只是剪葉4枝50%、75%誘導(dǎo)的PAL活性的反應(yīng)速度較相同損傷程度松毛蟲取食誘導(dǎo)更快，同時(shí)發(fā)現(xiàn)剪葉4枝50%誘導(dǎo)的PAL活性與相同損傷程度松毛蟲取食誘導(dǎo)無顯著差異(表2)，說明剪葉或松毛蟲取食激發(fā)了相同的苯丙氨酸反應(yīng)途徑。

表2 落葉松毛蟲取食剪葉程度不同的興安落葉松針葉PAL活性 U·mg-1

3 結(jié)論與討論

植物總是受到昆蟲或其他植食者的傷害，在與昆蟲的協(xié)同進(jìn)化過程中，植物自身已經(jīng)形成一套防御體系以避免或減少昆蟲危害，植物防御酶的合成是植物防御體系形成的重要前提［18-22］。不同程度的局部剪葉損傷，能強(qiáng)烈誘導(dǎo)興安落葉松針葉內(nèi)PPO和PAL的活性。PPO的活性在處理后的0.5 h顯著高于對照，在處理后的6 h達(dá)到最大值。剪葉4枝50%誘導(dǎo)的PPO活性最強(qiáng)，且酶活性的持續(xù)時(shí)間較長。Felton等發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物中PPO酶活性增加，會提高綠原酸的氧化作用，增加醌對氨基酸和蛋白的親核束縛作用［23］。如賴氨酸、組氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸的烷基化，使蛋白難以被昆蟲吸收，降低植物的營養(yǎng)價(jià)值、消化率及適口性。醌共價(jià)修飾的氨基酸可以與昆蟲腸胃里的消化酶結(jié)合使酶失活，減慢昆蟲的生長發(fā)育并促使其死亡［9-11］，事實(shí)證明松毛蟲的消化酶活性在取食24 h顯著下降［15］。本研究中，松毛蟲取食相同程度的落葉松針葉時(shí)，誘導(dǎo)的非損傷部位PPO活性高于剪葉損傷。落葉松毛蟲取食誘導(dǎo)的PPO活性在短暫升高后也迅速下降。袁紅娥［24］研究結(jié)果表明松毛蟲取食后，興安落葉松綠原酸含量下降。這表明了PPO參與興安落葉松的防御反應(yīng)，消耗了部分綠原酸，在興安落葉松的早期抗性反應(yīng)中發(fā)揮較大作用。

PAL是僅存在于植物和部分微生物體內(nèi)的酶類。許多試驗(yàn)證明，PAL活性高低與植物的抗蟲性有很大關(guān)系。蚜蟲侵染大麥、棉花后，引起PAL活性升高，在大麥中抗蚜品種的PAL活性以及水楊酸的含量均高于敏感品種［5］。本研究中，不同程度的局部剪葉損傷，均能強(qiáng)烈誘導(dǎo)興安落葉松針葉內(nèi)PAL的活性。剪葉4枝50%誘導(dǎo)的PAL活性較其它剪葉處理程度的反應(yīng)更加迅速，且活性最高。與剪葉相比，松毛蟲取食誘導(dǎo)了較高的PAL活性，剪葉4枝50%誘導(dǎo)的PAL活性與相同損傷程度松毛蟲取食誘導(dǎo)無顯著差異。剪葉或松毛蟲取食很有可能激發(fā)了相同的苯丙氨酸反應(yīng)途徑。PAL催化產(chǎn)生的黃酮類、生物堿及木質(zhì)素能夠有效封閉創(chuàng)傷、防止松毛蟲的進(jìn)一步取食。不同類型品種棉花在棉蚜為害脅迫下，PAL和多酚類含量均有不同程度上升，且抗蚜品種上升快［25-26］;用棉鈴蟲處理棉花后發(fā)現(xiàn)，隨PAL活性的增加，與細(xì)胞壁結(jié)合的酚類化合物大量積累［27］。這些研究印證了本研究結(jié)果以及PAL在落葉松中的抗蟲作用。

相對PPO，剪葉誘導(dǎo)PAL的反應(yīng)相對遲緩，但其持續(xù)時(shí)間較長，在120 h時(shí)，酶的活性仍保持較高水平，與對照差異極顯著。Neuvonen等［28］指出，植物的誘導(dǎo)防御甚至在葉片被取食后的1年內(nèi)都有效，木本植物的誘導(dǎo)抗性具有較長的滯后性，一棵樹體要恢復(fù)到被害前的狀態(tài)，即消除誘導(dǎo)防御的作用，至少需要3～4 a。因此推測PAL可能在興安落葉松的滯后性誘導(dǎo)抗性中發(fā)揮重要作用。

不同程度的局部剪葉損傷，均能強(qiáng)烈誘導(dǎo)興安落葉松針葉內(nèi)PAL和PPO的活性，但酶活性并沒有因損傷程度的增加而增加。剪葉4枝50%誘導(dǎo)的PAL活性較其它剪葉處理程度的反應(yīng)更加迅速，且活性最高。剪葉8枝、12枝誘導(dǎo)的PAL活性并沒有顯著高于4枝，并且在損傷后的120 h，PAL較剪葉4枝低。剪葉8枝、12枝誘導(dǎo)的PPO的活性低于剪葉4枝，且剪葉4枝所誘導(dǎo)的PPO活性的持續(xù)時(shí)間較長。說明利用損傷誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)過程中存在閾值。當(dāng)超過這個限度時(shí)，植物的防御能力非但不能增加反而會下降，不能提供足夠的有效成分防御外來威脅。從本研究的結(jié)果可以看出，以剪葉4枝50%誘導(dǎo)的防御酶的活性最高，持續(xù)性最強(qiáng)。

以上的討論總結(jié)出，興安落葉松的PPO和PAL均在其抗損傷和松毛蟲危害的過程中發(fā)揮了重要作用。PPO是興安落葉松先期防御的重要酶，能夠改變植物蛋白的結(jié)構(gòu)，其作用不可忽視。PAL作為苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶，在興安落葉松即時(shí)及滯后性誘導(dǎo)防御中發(fā)揮巨大作用。不同激發(fā)子誘導(dǎo)的興安落葉松防御反應(yīng)存在一定差異，但這種差別只表現(xiàn)在防御物質(zhì)的量上，松毛蟲取食與機(jī)械損傷誘導(dǎo)的PPO和PAL的激活速度以及酶活性的變化趨勢具有較高的擬合度，這似乎說明2種方法誘導(dǎo)防御反應(yīng)機(jī)制并沒有本質(zhì)區(qū)別。在以往對被子植物的研究中，也曾出現(xiàn)類似的結(jié)果［29］。因此，有望使用機(jī)械損傷從作用時(shí)間和作用方式上擬合昆蟲取食，誘導(dǎo)增強(qiáng)興安落葉松自主抗蟲能力，使預(yù)防和防治害蟲危害達(dá)到理想的效果。

［1］Maleck K，Dietrich R A.Defense on multiple fronts:how do plants cope with diverse enemies?［J］.Trends in Plant Science，1999，4(6):215-219.

［2］Constabel C P，Bergey D R，Ryna C A.Polyphenol oxidase as a component of the inducible defense response in tomato against herbivores［M］//Romeo J T，Saunders J A，Barbosa P.Phytochemical Diversity and Redundancy in Ecological Interactions.New York:Plenum Press，1996:231-252.

［3］Stout M J，Workman K V，Bostock R M，et al.Specificity of induced resistance in the tomato，Lycopersicon esculentum［J］.Oecologia，1998，113(1):74-81.

［4］Koussevitzky S，Ne’eman E，Harel E.Import of polyphenol oxidase by chloroplasts is enhanced by methyl jasmonate［J］.Planta，2004，219(3):412-419.

［5］Chaman M E，Copaja S V，Argando?a V H.Relationships between salicylic acid content，phenylalanine ammonia-lyase(PAL)activity，and resistance of barley to aphid infestation［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(2):2227-2231.

［6］Partington J C，Smith C，Bolwell G P.Changes in the location of polyphenol oxidase in potato(Solanum tuberosum L.)tuber during cell death in response to impact injury:comparison with wound tissue［J］.Planta，1999，207(3):449-460.

［7］Paul S，Gooding C B.Molecular cloning and characterization of banana fruit polyphenol oxidase［J］.Planta，2001，213(5):748-757.

［8］Duffey S S，F(xiàn)elton G W.Enzymatic antinutritive defenses of tomato plants against insects［M］//Hedin P A.Naturally occurring pest bioregulators. Washington:American Chemical Society，1991:176-197.

［9］Bittner S.When quinones meet amino acids:chemical，physical and biological consequences［J］.Amino Acids，2006，30(3):205-224.

［10］Felton G W，Tumlinson J H.Plant-insect dialogs:complex interactions at the plant-insect interface［J］.Current Opinion in Plant Biology，2008，11(4):457-463.

［11］Bhonwong A，Stout M J，Attajarusit J，et al.Defensive role of tomato polyphenol oxidases against cotton bollworm(Helicoverpa armigera)and beet armyworm(Spodoptera exigua)［J］.Journal of chemical ecology，2009，35(1):28-38.

［12］Buchanan B B，Gruissem W，Jones R L.Plant biochemistry and molecular biology(china pub)［M］.Beijing:Since Press，2004:1057-1084.

［13］江昌俊，余有本.苯丙氨酸解氨酶的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，28(4):425-430.

［14］de Sá M M，Subramaniam R，Williams F E，et al.Rapid activation of phenylpropanoid metabolism in elicitor-treated hybrid Poplar(Populus trichocarpa Torr.＆ Gray× Populus deltoides Marsh)suspension-cultured cells［J］.Plant physiology，1992，98(2):728-737.

［15］徐偉.興安落葉松誘導(dǎo)抗蟲性研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2006:1-123.

［16］Liu Taiguo，Li Yonghao，Shi Yanxia，et al.Induced resistance of tobacco to TM V with non-fungicidal chemical compounds［J］.Journal of Northeast Agricultural University，2002，33(2):129-133.

［17］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72(1/2):248-254.

［18］Bowles D J.Defuence-related proteins in higher plants［J］.Annual Review Biochemistry，1990，59:873-907.

［19］閆鳳鳴.化學(xué)生態(tài)學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2003:60-66.

［20］Keyan Z S，Bi Jianlong，Liu Tongxian.Molecular strategies of plant defense and insect counter-defense［J］.Insect Science，2005，12(1):3-15.

［21］Puthoff D P，Smigocki A C.Insect feeding-induced differential expression of Beta vulgaris root genes and their regulation by defenseassociated signals［J］.Plant cell reports，2007，26(1):71-84.

［22］Mith?fer A，Boland W.Recognition of herbivory associated molecular patterns［J］.Plant Physiology，2008，146(1):825-831.

［23］Felton G W，Donato K K，Broady R M，et al.Impact of oxidized plant phenolics on the nutritional quality of dietary protein to a noctuid herbivore，Spodoptera exigua［J］.Journal of Insect physiology，1992，38(4):277-285.

［24］袁紅娥.葉損傷誘導(dǎo)興安落葉松針葉中縮合單寧與酚酸的時(shí)序變化［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2008.

［25］許寧，陳雪芬，陳華才，等.茶樹品種抗茶橙癭螨的形態(tài)與生化特征［J］.茶葉科學(xué)，1996，16(2):125-130.

［26］李潤植，毛雪，李彩霞，等.棉花抗蚜性與次生代謝相關(guān)酶活性的關(guān)系［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，18(2):165-168.

［27］Kranthi S，Krannthi K R，Wanjari R R.Influence of semilooper damage on cotton host-plant resistance to Helicoverpa armigera(Hub)［J］.Plant Science，2003，164(7):157-163.

［28］Neuvonen S，Haukioja E，Molarius A.Delayed inducible resistance against a leaf-chewing insect in four deciduous tree species［J］.Oecologia，1987，74(3):363-369.

［29］Zong Na，Wang Chenzhu.Larval feeding induced defensive responses in tobacco:comparison of two sibling species of Helicoverpa with different diet breadths［J］.Planta，2007，226(1):215-224.