劉紅芳，肖龍泉，袁顯棚

（長(zhǎng)江師范學(xué)院，重慶涪陵，408100）

莖瘤芥 （Brassica junceavar.tumidaTsen et Lee）是重慶市三峽庫(kù)區(qū)農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一，是莖瘤芥主產(chǎn)區(qū)涪陵農(nóng)民收入的主要來(lái)源。此外，在重慶市的渝北、萬(wàn)州、長(zhǎng)壽、忠縣和豐都等地區(qū)，也有較大面積種植。隨著莖瘤芥種植面積的增加，黑斑病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，極大地影響了莖瘤芥的生產(chǎn)。引起十字花科蔬菜黑斑病的主要是半知菌亞門(mén)絲孢綱絲孢目鏈格孢屬真菌，包括蕓薹鏈格孢（Alternaria brassicae）、甘藍(lán)鏈格孢（A.brassicicola）和蘿卜鏈格孢（A.japonica）3個(gè)種[1]。鏈格孢屬內(nèi)不同種之間培養(yǎng)性狀不穩(wěn)定，且高度相似和重疊，在實(shí)際操作中用傳統(tǒng)方法很難鑒定到種的水平[2]。近年來(lái)，有學(xué)者在對(duì)十字花科蔬菜黑斑病菌3個(gè)種及相近種的5.8S rDNA和其側(cè)翼ITS區(qū)進(jìn)行測(cè)序的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)合成了鑒定白菜黑斑病菌3個(gè)種的特異性引物[3]。為了明確莖瘤芥黑斑病的病原，為該病害防治提供理論依據(jù)，對(duì)該病害的病原物進(jìn)行了分離鑒定，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病害標(biāo)本采集及病害病狀觀察

莖瘤芥黑斑病標(biāo)本于2011年12月分別在涪陵李渡、義和、焦石、馬武、農(nóng)科所等莖瘤芥種植區(qū)采集，并對(duì)田間病害植株進(jìn)行病害癥狀觀察記錄。

1.2 病原菌的分離和培養(yǎng)

采用馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂培養(yǎng)基（PDA）進(jìn)行常規(guī)組織分離培養(yǎng)。分離到的菌株經(jīng)單孢純化后保存于PDA斜面上，置于4℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測(cè)定

采用活體接種法。在無(wú)菌環(huán)境下挑取孢子并將其接入無(wú)菌水中，制備接種液，對(duì)健康的葉片采用正背面噴霧接種，重復(fù)噴霧3次，同時(shí)對(duì)對(duì)照組噴無(wú)菌水，最后在植株葉片上套上塑料袋，室內(nèi)25℃保濕培養(yǎng)并進(jìn)行觀察[4]。根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行再分離，顯微鏡下觀察分離得到的病菌是否與原接種菌株相同。

1.4 PDA培養(yǎng)基上病原菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征觀察

將單孢分離純化的菌株接種到PDA培養(yǎng)基平板上，置于25℃光照黑暗交替條件下培養(yǎng)7 d后，觀察菌株培養(yǎng)性狀，鏡檢孢子形態(tài)特征，測(cè)量孢子大小，根據(jù)病原菌的產(chǎn)孢表型及在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，初步鑒定到屬或種。

1.5 病原菌的PCR鑒定

基因組DNA提取采用CTAB法[5]，PCR反應(yīng)條件和引物設(shè)計(jì)參考肖長(zhǎng)昆等[3]的方法，用Abre1和Abre2、Abra1和 Abra2、Ajap1和 Ajap2這 3對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀特點(diǎn)

該病原菌寄生在植株葉片上，主要為害葉片，少數(shù)病斑生長(zhǎng)在葉脈上。開(kāi)始發(fā)病的時(shí)候，葉片上出現(xiàn)黑色的小斑點(diǎn)，隨著病斑的擴(kuò)大，形狀近橢圓形或圓形，有的病斑連成一片，病斑中間部分顏色逐漸變淡，邊緣為褐色并不斷向周圍蔓延。田間病斑直徑大多在3～12 mm，發(fā)病后期病斑中央葉片組織壞死呈白色，在邊緣處可見(jiàn)但不十分明顯的同心紋，邊緣呈褐色（圖1）。

2.2 致病性測(cè)定

本研究采用了活體接種，結(jié)果導(dǎo)致健康植株發(fā)病。在活體接種發(fā)病后，從病葉上分離出病菌，發(fā)現(xiàn)其與田間發(fā)病病葉上分離出的病菌相同，由此可以證明引起莖瘤芥黑斑病的病原菌為鏈格孢屬 （Alternaria）真菌。

2.3 病原菌的培養(yǎng)特征

菌株在PDA培養(yǎng)基上，置于25℃進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，3 d后開(kāi)始出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的白色菌斑；培養(yǎng)5 d后，菌斑直徑為12～13 mm，邊緣菌絲呈白色，中間顏色逐漸加深呈褐色（圖2）。25℃培養(yǎng)7 d后，菌落產(chǎn)生大量分生孢子且直徑達(dá)到23 mm左右。隨著溫度升高至30℃，菌落中間顏色變淺，邊緣仍為白色，孢子產(chǎn)量急劇減少。隨著時(shí)間增加，菌落將布滿整個(gè)培養(yǎng)皿；在厚度較薄的培養(yǎng)基中，由于缺乏營(yíng)養(yǎng)，菌落生長(zhǎng)到一定階段便停止，孢子數(shù)量增多，顏色逐漸變?yōu)槟G色。

2.4 病原菌鑒定結(jié)果

挑取培養(yǎng)7 d后的菌絲制片，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)大量分生孢子梗和分生孢子。分生孢子呈黃褐色，有隔，頂端顏色較淺，孢子中間部分稍稍膨大，沒(méi)有分枝，有0～3個(gè)橫隔膜，3～9個(gè)縱隔膜。分生孢子單個(gè)著生或3～6個(gè)串生，大多形狀若蛆蟲(chóng)，兩頭比中間細(xì)且顏色逐漸變淺，基部相對(duì)頂端粗而短；少數(shù)形態(tài)無(wú)明顯特征，喙無(wú)色至淺褐色，大小為（43～96）μm×（10～25）μm（圖 2）。 根據(jù)以上形態(tài)特征，參照真菌分類的相關(guān)文獻(xiàn)[6～8]，初步確認(rèn)莖瘤芥黑斑病病原菌為半知菌亞門(mén)、鏈格孢屬（Alternaria）真菌。

圖1 莖瘤芥黑斑病田間癥狀

圖2 鏈格孢分生孢子及其菌落

2.5 分子鑒定結(jié)果

隨機(jī)挑取在5個(gè)采集點(diǎn)采集分離得到的單孢系中的 5 個(gè)， 其編號(hào)分別為 No.1，No.2，No.3，No.4，No.5，菌絲經(jīng)過(guò)液體振蕩培養(yǎng)，提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果分離物均由特異引物Abre1和Abre2擴(kuò)增出了371 bp的目標(biāo)條帶，而甘藍(lán)鏈格孢和蘿卜鏈格孢的特異引物未擴(kuò)增出條帶（圖3），說(shuō)明致病病原菌是蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae。

3 小結(jié)與討論

經(jīng)過(guò)對(duì)病害癥狀特點(diǎn)的觀察和病葉標(biāo)樣的分離、培養(yǎng)、致病性測(cè)定，以及PCR鑒定，初步確定引起莖瘤芥黑斑病的病原菌為蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae。

在莖瘤芥主產(chǎn)區(qū)涪陵只發(fā)現(xiàn)蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae一種病原。其原因可能是：①采集地點(diǎn)過(guò)于集中，導(dǎo)致鑒定菌種均為蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae；②李明遠(yuǎn)[1]對(duì)秋冬白菜黑斑病研究表明，秋冬白菜黑斑病一般由蕓薹鏈格孢引起，這與同為十字花科的莖瘤芥黑斑病發(fā)病季節(jié)相吻合，其原因可能是甘藍(lán)鏈格孢與蘿卜鏈格孢在溫度較低時(shí)一般不能侵染寄主。對(duì)于莖瘤芥黑斑病是否只由蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae一個(gè)種引起，還有待進(jìn)一步研究確定。

圖3 引物對(duì)Abrel-Abre2 PCR擴(kuò)增Alternaria屬真菌基因組DNA結(jié)果

[1]李明遠(yuǎn).十字花科蔬菜黑斑病識(shí)別與防治[J].當(dāng)代蔬菜，2004（10）：34-35.

[2]肖長(zhǎng)坤，李勇，李健強(qiáng).十字花科蔬菜種傳黑斑病研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào)，2003，8（5）：61-68.

[3]肖長(zhǎng)坤，李健強(qiáng)，師迎春，等.十字花科蔬菜黑斑病菌的PCR 鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)，2005，35（3）：278-282.

[4]方中達(dá).植病研究方法.3版[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996：193-195.

[5]Graham G C,Mayser S P,Henry R J.A simplified method for the preparation of fungal genomic DNA for PCR and RAPD analysis[J].Biotechniques,1994,16(1):48-50.

[6]張?zhí)煊?中國(guó)真菌志:鏈格孢屬（第十六卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1998.

[7]文朝慧，李鐵夫，王軍平，等.出口蘿卜種子中蕓薹生鏈格孢的分離與鑒定[J].植物檢疫，2007（1）：4-6.

[8]張毅，徐進(jìn)，李婷，等.十字花科蔬菜黑斑病又稱黑霉病的識(shí)別與防治[J].西北園藝：蔬菜，2010（2）：43.