倪文靜，朱述陽，劉文靜，吳 瑕，陳云峰，趙 玲

（徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇徐州221002）

瘦素，為一種相對(duì)分子質(zhì)量為16×103的激素，主要由脂肪細(xì)胞分泌，在免疫系統(tǒng)和炎癥中起著多方面的作用［1］。瘦素與瘦素受體（OB－R）結(jié)合通過激活磷脂酰肌醇－3－OH激酶和分裂素活化的蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路發(fā)揮其作用［2］。瘦素濃度在過敏性氣道中是增加的，可能在肥胖和哮喘的關(guān)系中起著作用［3］。但瘦素與瘦素受體的作用通路及發(fā)病機(jī)制在哮喘患者的氣道中的作用仍不清楚。最新研究證實(shí)瘦素可能在促進(jìn)氣道炎癥的同時(shí)，參與了哮喘的氣道重構(gòu)過程，瘦素失衡可能是肥胖哮喘小鼠氣道損傷和重建的重要因素［4］。本小組前期研究表明瘦素可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth cells，ASMCs）的增殖［5］，但是瘦素對(duì) ASMCs凋亡的影響尚無相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究目的旨在探討瘦素是否可通過與ASMCs上瘦素受體的結(jié)合來抑制細(xì)胞的凋亡，從而可以進(jìn)一步的了解瘦素對(duì)ASMCs的作用。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：150～200g SD雌性大鼠2只由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑與儀器：細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）購自GIbIco公司；瘦素購自Alexis公司；兔抗鼠瘦素受體的抗體BY－0961Rleptin receptor（L）購自上海博華生物科技有限公司；兔抗大鼠白血?。瓁l（Bcl－xl）抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase－3）抗體購自北京中杉公司；Annexin VFITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠ASMCs的培養(yǎng) 水合氯醛麻醉大鼠后，在無菌下剖取氣管約1.5cm放入超凈臺(tái)，將氣管段剪成1mm×1 mm的組織塊，貼于培養(yǎng)瓶的側(cè)面，加入含25%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)液2mL于瓶內(nèi)，于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱靜置，3～4h之后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，半開放式于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后，添加3mL的培養(yǎng)液于瓶內(nèi)，培養(yǎng)約6d可換液，此后每3天換液1次。待細(xì)胞長滿瓶壁后傳代培養(yǎng)，選第4～6代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞鑒定 （1）細(xì)胞形態(tài)學(xué)：倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的大小、形態(tài)及排列方式等；（2）免疫熒光染色法：把收集好的細(xì)胞加入消毒好的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，DMEM補(bǔ)齊至2mL。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞融合約50%～60%時(shí)取出玻片，加3.7%甲醛液在室溫下固定30min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2次，每次5 min，用0.1%山羊血清封閉特異性抗原30min，抗SMC－α－actin（1∶200PBS稀釋）室溫孵育細(xì)胞2h后，加入熒光標(biāo)記二抗（1∶200PBS稀釋）在4℃孵育過夜，第2天用熒光封片劑封閉后在熒光顯微鏡下檢測(cè)。

1.2.3Western blot法檢測(cè)瘦素受體蛋白 （1）分別提取未經(jīng)瘦素干預(yù)和瘦素干預(yù)后的ASMCs蛋白備用。（2）用啉甲酸（BCA）蛋白實(shí)驗(yàn)法測(cè)量蛋白的濃度，配膠后，在每個(gè)上樣孔中加入30μL的蛋白提取液，電壓80V電泳，電流40mA轉(zhuǎn)膜。然后把纖維膜取出，放入30g/L的封閉液中封閉3h，按一抗∶洗 滌緩沖液（Washing Buffer）∶30g/L 牛血清蛋白（BSA）＝3∶2∶1加入二抗，孵育2h，配制顯色液，緩沖液（AP Buffer）∶四氮唑藍(lán)（NBT）∶甲苯胺藍(lán)（BCIP）＝10mL∶66μL∶33μL，加入顯色液約2h，用NBT/BCIP顯色后用Image J軟件分析條帶的灰度。

1.2.4Western blot法測(cè)定caspase－3和Bcl－xl蛋白的表達(dá)方法同上。封閉后，用washing Buffer洗滌3次，分別放入含10%的caspase－3和Bcl－xl抗體孵育，2h后配制顯色液按上述方法顯色后觀察結(jié)果。用NBT/BCIP顯色后用Image J軟件分析條帶的灰度值，計(jì)算 Bcl－xl/β－actin和caspase－3/β－actin的比值。

1.2.5Annexin V－FITC/PI測(cè)定細(xì)胞凋亡率 將第四代的ASMCs按1×105/孔接種于4個(gè)6孔板培養(yǎng)24h，再加入純的DMEM培養(yǎng)24h，換1%含血清的DMEM，隨機(jī)分為7組：空白對(duì)照組（A組）；20μg/mL瘦素組（B組）；40μg/mL瘦素組（C組）；60μg/mL 瘦素組（D 組）；80μg/mL 瘦素組（E 組）；100μg/mL瘦素組（F組）；100μg/mL瘦素＋BY－0961RLeptin receptor組（G組）。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，用胰酶消化收集細(xì)胞離心5min。棄上清液后轉(zhuǎn)移至標(biāo)記好的EP管中。每管中加入Annexin V－FITC輕輕重懸細(xì)胞，加入PI避光反應(yīng)10min，隨即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以s表示。組間比較采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson等級(jí)相關(guān)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ASMCs的鑒定 倒置顯微鏡放大100倍，細(xì)胞呈長梭形，貼壁平行生長，束狀排列，密集與稀疏處相互交錯(cuò)（封4圖1A）。免疫熒光染色法證明：抗平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體呈陽性染色的細(xì)胞內(nèi)可見大量的綠色熒光，說明所培養(yǎng)的細(xì)胞為ASMCs（封4圖1B）。

2.2瘦素受體的鑒定 Western blot法顯示在相對(duì)分子質(zhì)量（95～130）×103之間有明顯的條帶。見封4圖2。

2.3瘦素對(duì)ASMCs凋亡的影響 瘦素分別作用于ASMCs 48h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組的凋亡率，B、C、D、E、F組細(xì)胞的凋亡率分別為（5.16±0.99）%、（3.45±0.82）%、（2.90±0.18）%、（1.68±0.87）%、（1.08±0.26）%均低于A組（6.48±0.76）%（P＜0.05），且各組細(xì)胞凋亡率與瘦素濃度呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.992，P＜0.01），加入瘦素受體抗體的 G組細(xì)胞的凋亡率為（3.12±0.76）%，較F組明顯升高（P＜0.05）。

2.4瘦素對(duì)caspase－3表達(dá)的影響 Western blot表明不同濃度瘦素處理后，ASMCs內(nèi)裂解的caspase－3表達(dá)減少，并與濃度呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.932，P＜0.01），見圖3。

2.5瘦素對(duì)ASMCs內(nèi)Bcl－xl蛋白的影響 Western blot結(jié)果示隨著瘦素濃度的增加，對(duì)抑制細(xì)胞凋亡的Bcl－xl蛋白的表達(dá)逐漸增多，且與濃度呈正相關(guān)（r＝0.974，P＜0.01），見圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)各組Bcl－xl蛋白的表達(dá)

3 討 論

在過去的幾年中，許多的研究證實(shí)了瘦素在呼吸系統(tǒng)中潛在作用?；谶@樣的研究，研究者們?cè)噲D證明瘦素在特殊的呼吸系統(tǒng)紊亂中的作用，包括慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、哮喘、肺癌。本研究證明了瘦素與瘦素受體結(jié)合抑制了大鼠ASMCs的凋亡，瘦素可以使參與細(xì)胞凋亡的蛋白caspase－3表達(dá)減少，使抑制細(xì)胞凋亡的蛋白Bcl－xl表達(dá)減少。其中瘦素抑制ASMCs凋亡的作用機(jī)制尚在研究之中。

瘦素可以通過STAT－3的活化途徑體外刺激人的單核細(xì)胞增殖［6］。而且最近一篇文獻(xiàn)已經(jīng)證明了瘦素受體在大鼠ASMCs上有表達(dá)，瘦素與瘦素受體結(jié)合可體外刺激大鼠ASMCs的增殖［5］，這說明它可能在哮喘ASMCs增殖中起著一定的作用。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了瘦素受體在大鼠ASMCs中有表達(dá)。而且肺組織中有瘦素受體基因的表達(dá)；在一些動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了肺組織上的瘦素受體［7］，更重要的是，有研究發(fā)現(xiàn)了肺組織細(xì)胞中有瘦素受體b型（OB－R b）的表達(dá)［8］，本實(shí)驗(yàn)Western blot顯示在95×103與130×103之間有明顯條帶，與瘦素受體OB－R b 120×103的相對(duì)分子質(zhì)量相符。說明ASMCs上有長型瘦素受體的表達(dá)。

有研究表明瘦素可以避免T淋巴細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)T－Cell的增殖和活化，并促進(jìn)血管的生成［9］。哮喘是以氣道重塑為主的慢性氣道炎癥，主要表現(xiàn)為氣道內(nèi)上皮細(xì)胞的脫落、基底膜的增厚等，且有研究證實(shí)了瘦素本身不促進(jìn)平滑肌的增殖、遷移或細(xì)胞因子的合成，這說明了肥胖對(duì)哮喘的影響不能歸因于瘦素直接對(duì)ASMCs的作用［10］。

有研究證實(shí)了瘦素可以通過激活p－ERK和PI－3K的機(jī)制體外促進(jìn)大鼠ASMCs細(xì)胞的增殖［5］，而對(duì)大鼠ASMCs細(xì)胞的凋亡率的影響卻沒有相關(guān)的研究。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的瘦素體外刺激大鼠ASMCs 48h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)法和Western blot法來觀察瘦素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；結(jié)果顯示了瘦素可與ASM細(xì)胞膜上的瘦素受體結(jié)合通過相應(yīng)的作用機(jī)制及相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系而實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致裂解的caspase－3的減少，Bcl－xl的增加，并具有明顯的濃度依賴性，于100μg/mL時(shí)達(dá)到高峰，當(dāng)在F組中加入BY－0961RLeptin receptor后，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ASMCs的凋亡率明顯升高，從而證實(shí)了BY－0961RLeptin receptor可通過與受體結(jié)合抑制瘦素對(duì)細(xì)胞的抗凋亡作用。瘦素也可以保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧－再灌注或是過氧化氫誘導(dǎo)的凋亡［11］，說明瘦素在細(xì)胞保護(hù)中可能起著重要的作用。

caspase家族在細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用，caspase－3在凋亡過程中起著重要的作用，細(xì)胞凋亡的過程是caspase－3不可逆水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過程［12］，它可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，核纖層蛋白可被caspase－3在一個(gè)近中部的固定部位所裂解，使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，不同濃度的瘦素干預(yù)ASMCs后，可使裂解的caspase－3蛋白表達(dá)明顯增多，且與瘦素濃度呈負(fù)相關(guān)，說明caspase－3參與瘦素對(duì)ASMCs的凋亡作用。

Bcl－xl蛋白是BCL蛋白家族的成員之一，是細(xì)胞中抑制細(xì)胞凋亡的重要分子之一，Bcl－xl是結(jié)構(gòu)上與Bcl－2具有43%同源性的蛋白與Bcl－2的作用相同，可抑制細(xì)胞凋亡。Bcl－xl的過度表達(dá)可引起細(xì)胞核谷胱苷肽（GSH）的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低caspase－3酶的活性。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的瘦素可以通過增加Bcl－xl蛋白的表達(dá)使caspase－3蛋白減少且與瘦素濃度呈正相關(guān)（P＜0.01）。當(dāng)加入瘦素受體抑制劑時(shí)，caspase－3蛋白的表達(dá)明顯增多，Bcl－xl蛋白表達(dá)明顯減少。這說明了二者在瘦素對(duì)ASMCs的抑制凋亡作用中發(fā)揮重要的作用，共同參與細(xì)胞的凋亡過程。

總之，瘦素可以在體外與大鼠ASMCs的瘦素受體結(jié)合，增加Bcl－xl的表達(dá)，抑制裂解caspase－3的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)ASMCs的保護(hù)。其中的作用機(jī)制尚不清楚，可能是PI－3K和MAPK通路發(fā)揮其作用，這有待進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

［1］Matarese G，Mantzoros C，La Cava A.Leptin and adipocytokines：bridging the gap between immunity and athero－sclerosis［J］.Curr Pharm Des，2007，13（36）：3676－80.

［2］Conus S，Bruno A，Simon HU.Leptin is an eosinophil survival factor［J］.J Allergy Clin Immunol，2005，116（6）：1228－1234.

［3］Shore SA，Schwartzman IM，Mellema MS，et al.Effect of leptin on allergic airway responses in mice［J］.J Allergy Clin Immunol，2005，115（1）：103－109.

［4］蘇毅，王欣，唐彩月，等.瘦素在肥胖哮喘小鼠氣道重構(gòu)中的作用［J］.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2010，14（7）：6－9.

［5］何淑敏，朱述陽，李慧婷，等.瘦素對(duì)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（8）：849－855.

［6］Matarese G，Moschos S，Mantzoros CS.Leptin in immunology［J］.J Immunol，2005，174（6）：3137－3142.

［7］Hoggard N，Trahum P，Mecer JG.Leptin and leptin receptor mRNA and Proteins expression in the murine foetus and placenta［J］.Proc Natl Aced Science USA，1997，94（20）：11073－11078.

［8］Bruno A，Pace E，chain P，et al.Leptin receptor expression in asthma［J］.J Allergy Clin Immune，2009，124（21）：230－237.

［9］Hersoug LG，Linneberg A.The link between the epidemics of obesity and allergic disease：does obesity induce decreased immune tolerance？［J］.Allergy，2007，62（10）：1205－1213.

［10］Nair P，Radford K，F(xiàn)anat A，et al.The effects of leptin on airway smooth muscle responses［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2008，39（4）：475－481.

［11］Shin EJ，Schram K，Zheng XL，et al.Leptin attenuates hypoxia/reoxygenation－induced activation of the intrinsic pathway of apoptosis in rat H9c2cells［J］.J Cell Physiol，2009，221（2）：490－497.

［12］Lakhani SA，Masud A，Kuida K，et al.caspase 3and 7：key mediators of mitochondrial events of apoptosis［J］.Science，2006，311（5762）：847－851.