丁光榮，張俊文

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科 400016）

Barrett食管（Barrett′s esophagus，BE）是可能引發(fā)食管末端及胃食管交接處腺癌的高風(fēng)險疾病之一［1］，干細(xì)胞分化紊亂是其可能的發(fā)病機制，調(diào)控干細(xì)胞分化的各種轉(zhuǎn)錄因子和基因突變有可能是食管干細(xì)胞腸化生的重要分子基礎(chǔ)。缺氧誘導(dǎo)因子－1α（hypoxia inducible factor－1α，HIF－1α）是細(xì)胞應(yīng)激缺氧時所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄激活因子，突變型P53（mtP53）及Insulin－like growth factor－Ⅱ mRNA－binding protein 3（IMP3）與很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。三者共同在Barrett食管形成過程中所起作用并少見報道，本文通過研究這3種蛋白在Barrett食管及反流性食管炎中的表達(dá)，探討三者在Barrett食管發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 標(biāo)本來自本院消化內(nèi)鏡中心2010年1月至2011年12月胃鏡活檢，經(jīng)病理確診為Barrett食管患者100例。其中男58例，女42例；年齡18～67歲，平均（51.55±11.83）歲。反流性食管炎組織取自同期胃鏡標(biāo)本，經(jīng)病理證實為反流性食管炎的患者50例，其中男28例，女22例；年齡19～63歲，平均（46.90±13.11）歲，兩組一般情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2主要試劑 HIF－1α、IMP3兔抗人單克隆抗體購自美國Epitomics公司，mtP53兔抗人單克隆抗體購自武漢三鷹公司，免疫組織化學(xué)SP試劑盒由北京康為世紀(jì)公司提供。

1.3檢測方法 每一例標(biāo)本均行4μm連續(xù)切片，分別進行HIF－1α、mtP53、IMP3免疫組織化學(xué)染色（均采用 SP法）和HE染色。用已知陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。HIF－1α多克隆抗體稀釋度數(shù)為1∶200，mtP53、IMP3多克隆抗體稀釋度數(shù)為1∶100。

1.4結(jié)果判定 HIF－1α、mtP53蛋白以細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為陽性，IMP3蛋白以細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒為陽性，對各組標(biāo)本作免疫組織化學(xué)染色陽性評分，依照細(xì)胞陽性著色程度（抗原含量），陰性（－）著色為0分、淡黃色弱陽性（＋）為1分、淺褐色中等陽性（＋＋）為2分、深褐色強陽性（＋＋＋）為3分。每個視野總分為：（＋）%×1＋（＋＋）%×2＋（＋＋＋）%×3；每張切片在高倍鏡下（×400）隨機選擇5個視野，最后取均值為該標(biāo)本的最后得分。分值小于0.5者為陰性，≥0.5～＜1.0者為弱陽性，≥1.0～＜1.5者為中等陽性，≥1.5者為強陽性。同時用Image－pro plus6.0專業(yè)圖像分析系統(tǒng)對切片做蛋白表達(dá)的半定量分析。對同一種蛋白表達(dá)的不同切片分析時，先選擇一較典型的照片進行光密度校正、光平衡校正、分析環(huán)境選擇、選色，然后按照這一固定的條件分析其余照片。每張切片在高倍鏡下（×400）隨機選擇5個視野進行照相，每張照片以總光密度（IOD）作為累積光密度，以照片的總面積（Area）作為面積，計算平均光密度（mean density）＝ 總光密度/總面積，作為一張照片的免疫組織化學(xué)陽性指數(shù)，5張照片的均值作為一張切片的陽性指數(shù)參與統(tǒng)計分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0軟件。計量資料以s表示，均數(shù)比較用t檢驗，定性資料用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。參數(shù)間的相關(guān)性用pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1HIF－1α、mtP53、IMP3蛋白陽性表達(dá)綜合評分結(jié)果 用綜合評分方法對免疫組織化學(xué)切片進行分析顯示，HIF－1α在Barrett食管組中弱陽性6例，中等陽性27例，強陽性21例，共54例（占54%），主要集中在腺管部單層柱狀上皮細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也偶呈淡黃色表達(dá)，反流性食管炎組中只有7例弱陽性表達(dá)，占14%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；mtP53在Barrett食管組中弱陽性16例，中等陽性7例，強陽性6例，共29例（占29%），主要為細(xì)胞核內(nèi)深褐色顆粒，也以腺管細(xì)胞為主，反流性食管炎組中弱陽性2例，中等陽性2例，共4例（占8%），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IMP3在Barrett食管組中弱陽性6例，中等陽性24例，強陽性15例，共45例（占45%），主要為細(xì)胞質(zhì)中淡黃色到深褐色顆粒，除腺管部表達(dá)較多外，基質(zhì)及周圍表皮細(xì)胞中也有少量表達(dá)。而在反流性食管炎組中表達(dá)較少，只有弱陽性10例（占10%），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見封3圖1～6。

2.2HIF－1α、mtP53、IMP3蛋白陽性表達(dá)平均光密度定量分析結(jié)果 用Image－pro plus6.0軟件對免疫組織化學(xué)照片進行平均光密度定量分析顯示，Barrett食管組中 HIF－1α、mtP53、IMP3表達(dá)與反流性食管炎組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 HIF－1α、mtP53、IMP3蛋白表達(dá)平均光密度值（s）

表1 HIF－1α、mtP53、IMP3蛋白表達(dá)平均光密度值（s）

＊：P＜0.05，＃：P＜0.01，與反流性食管炎組比較。

組別 HIF－1α 0.35±0.09 0.15±0.14 0.08±0.12 Barrett食管組 0.60±0.09＃ 0.57±0.11＊ 0.42±0.08 mtP53 IMP3反流性食管炎組＃

2.3HIF－1α、mtP53、IMP3蛋白表達(dá)之間的關(guān)系 對100例Barrett食管標(biāo)本和50例反流性食管炎標(biāo)本3種蛋白陽性表達(dá)的平均光密度值行簡單pearson相關(guān)分析和偏相關(guān)分析，結(jié)果如下：HIF－1α表達(dá)與IMP3表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.910，P＝0.000）；mtP53表達(dá)與IMP3表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.890，P＝0.001）；控制IMP3的偏相關(guān)分析顯示，HIF－1α與 mtP53表達(dá)之間呈正相關(guān)（r＝0.941，P＝0.000）；三者之間均呈正相關(guān)性。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)HIF－1α不僅與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，并能影響多種干細(xì)胞的分化過程［2－5］。本研 究發(fā)現(xiàn)，HIF－1α在 Barrett食管黏膜中的表達(dá)明顯高于反流性食管炎黏膜組織，表明HIF－1α在食管黏膜被反流物損傷后的修復(fù)過程中，可能抑制了食管正常分化程序，激活腸化柱狀上皮的分化程序。因此，認(rèn)為Barrett食管實際上是食管黏膜組織對局部損傷的一種不完全修復(fù)形式，而HIF－1α有可能是參與Barrett化生形成的轉(zhuǎn)錄因子之一。mtP53可能導(dǎo)致食管腫瘤的發(fā)生［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，mtP53在反流性食管炎組表達(dá)和Barrett食管組有顯著差異，表明P53基因在反流性食管炎時已經(jīng)少量突變，隨病情進展，mtP53的表達(dá)量增加，認(rèn)為P53基因突變是Barrett食管的早期基因變化之一。IMP3屬于胰島素樣生長因子ⅡmRNA結(jié)合蛋白家族中的成員之一，能促進細(xì)胞的異常生長增殖，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是很多腫瘤非常有價值的診斷和預(yù)后指標(biāo)［7－12］。本研究結(jié)果顯示，IMP3在Barrett食管組中表達(dá)升高，與反流性食管炎組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明Barrett食管存在細(xì)胞異常增殖，并有惡化傾向。

本研究結(jié)果顯示，HIF－1α分別與mtP53、IMP3表達(dá)之間呈顯著正相關(guān)。說明Barrett食管在形成后即存在細(xì)胞的異常增殖和惡變傾向，而HIF－1α、mtP53、IMP3之間可能存在著協(xié)同關(guān)系，有可能是促進食管多能干細(xì)胞向腸化的單層柱狀上皮細(xì)胞方向異常分化、并惡性增殖的原因之一。

本研究認(rèn)為HIF－1α、mtP53、IMP3三者在Barrett食管發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，可能是Barrett食管形成的始動機制之一。

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