鄧家波，楊曉梅，王 強(qiáng)，李興玉，余建秋，廖黨金，牛李麗，林 毅，嚴(yán)慧娟，謝 晶

（1.成都動(dòng)物園 成都市野生動(dòng)物研究所，四川 成都 610081；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科A型流感病毒引起的禽類一種嚴(yán)重傳染病，也是第1個(gè)實(shí)行全球性監(jiān)測(cè)的傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的傳染病。高致病性禽流感可引起禽類大批發(fā)病死亡[1－2]，同時(shí)也會(huì)感染野生鳥類和人類[3－6]。目前流行于中國大陸的禽流感病毒主要血清型是H5亞型和H9亞型，H5亞型禽流感病毒是主要的高致病性毒株，可引起禽類大批急性發(fā)病死亡[7]；H9亞型禽流感病毒多為低致病性毒株，主要引起產(chǎn)蛋下降或呼吸道癥狀[8]。近年來，禽流感在野生鳥類、動(dòng)物園珍禽中也有暴發(fā)的情況[9－11]，不僅對(duì)珍稀野禽的繁育保護(hù)帶來巨大的挑戰(zhàn)，還對(duì)人的健康造成很大的威脅[12]。因此，采取有效的預(yù)防措施加強(qiáng)對(duì)野禽類的保護(hù)，不僅可以防止疫情的暴發(fā)，還可以保證人類的公共衛(wèi)生安全。目前最有效的措施就是免疫接種，而我國沒有專門用于珍禽的禽流感疫苗，珍禽禽流感的防控只能使用家禽禽流感疫苗[13－15]。而關(guān)于此類疫苗用于珍禽的免疫安全性及免疫效果的研究報(bào)道在國內(nèi)外都比較少。本研究擬對(duì)家禽用禽流感（H5＋H9）二價(jià)滅活疫苗免疫接種動(dòng)物園成年珍禽后的血清抗體消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行研究，并結(jié)合動(dòng)物園的實(shí)際建立一個(gè)合理的免疫程序。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 禽流感（H5＋H9）二價(jià)滅活疫苗，批號(hào)：2009008，哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.1.2 試驗(yàn)用動(dòng)物 成都動(dòng)物園圈養(yǎng)的8種珍禽，包括孔雀6只，原雞6只，雉雞4只，白冠長(zhǎng)尾雉6只，東方白鸛2只，斑頭雁4只，赤麻鴨2只，鴛鴦2只。

1.1.3 試劑 H5亞型禽流感抗原、陽性血清（批號(hào)分別為200901、200801）；H9亞型禽流感抗原、陽性血清（批號(hào)分別為07102101、080305），均購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.4 10mL／L紅細(xì)胞懸液 采集3只未免疫禽流感疫苗的健康公雞血液與等體積阿氏液混合，用pH 7.2的0.01mo1／L PBS液離心洗滌3次，洗滌后用PBS配成體積分?jǐn)?shù)為10mL／L紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 免疫接種 用禽流感疫苗免疫接種成都動(dòng)物園圈養(yǎng)的8種珍禽，每種珍禽隨機(jī)分為2組，分別于胸肌肌肉注射0.5mL／羽和1.0mL／羽，所有免疫接種珍禽都套上腳標(biāo)，做好編號(hào)。

1.2.2 血清采集 對(duì)孔雀、東方白鸛等珍禽分別在免疫接種前、免疫接種后14、21、35、90、150、222、280、340、400d（論文的表中分別用 B、A14、A21、A35、A90、A150、A222、A280、A340、A400表示免疫接種前及免疫接種后的各時(shí)間段）翅下靜脈采集試驗(yàn)血液；對(duì)白冠長(zhǎng)尾雉、赤麻鴨等珍禽分別在免疫接種前、免疫接種后14、21、35、90、126d（加強(qiáng)免疫時(shí)間）、二免后14、24、98、155、210d（文的表中分別用B、A14、A21、A35、A90、A126、As14、As24、As98、As155、As210表示免疫接種前、免疫接種后及二免后的各時(shí)間段）翅下靜脈采集血液，待血清析出后，8000r／min離心4min，吸出血清，同時(shí)在離心管壁標(biāo)注腳標(biāo)號(hào)，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體檢測(cè) 按《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB／T 18936－2003）所規(guī)定的方法，分別用 H5亞型和H9亞型禽流感病毒HI標(biāo)準(zhǔn)抗原，進(jìn)行免疫抗體水平檢測(cè)。

1.2.4 結(jié)果判定 以完全抑制4個(gè)血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI效價(jià)，只有陰性對(duì)照孔效價(jià)不大于2log2，陽性對(duì)照孔效價(jià)誤差不超過1個(gè)log2時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果才有效。按照農(nóng)業(yè)部相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，禽流感HI效價(jià)≥4log2判為免疫合格。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用EXCEL和SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

根據(jù)各種珍禽疫苗后的免疫應(yīng)答效果，即產(chǎn)生禽流感H5、H9亞型抗體的水平高低，將結(jié)果分為兩個(gè)種群，其中孔雀、原雞、東方白鸛、斑頭雁免疫應(yīng)答結(jié)果較好，即抗體水平較高，而白冠長(zhǎng)尾雉、雉雞、赤麻鴨、鴛鴦、免疫效果則相對(duì)較差。

2.1.1 孔雀、東方白鸛等免疫應(yīng)答好的珍禽血清禽流感病毒抗體效價(jià)檢測(cè) 對(duì)動(dòng)物園圈養(yǎng)的孔雀、原雞、東方白鸛、斑頭雁4種野生珍禽，按0.5mL／羽和1.0mL／羽分成兩組分別免疫接種注射禽流感H5N1－H9N2二價(jià)滅活苗，免疫效果良好。這4種珍禽群體H5、H9亞型禽流感病毒抗體值消長(zhǎng)規(guī)律及免疫合格率分別見表1、表2。

表1 孔雀等4種珍禽H5亞型禽流感病毒抗體值消長(zhǎng)規(guī)律及免疫接種合格率Table1 Immune antibody dynamics and antibody qualification rate of avian influenza virus H5antibody in 4species of rare birds

孔雀、原雞H5亞型禽流感病毒抗體水平免疫接種前都低于4log2，斑頭雁H5亞型抗體水平免疫接種前雖然高于4log2，但免疫合格率只有50%，免疫接種后14d開始 ，4種珍禽的抗體水平均很快上升，21d抗體水平達(dá)高峰，以后抗體水平開始下降。免疫應(yīng)答好的珍禽孔雀、東方白鸛、斑頭雁H5亞型抗體在免疫接種后400d仍能維持較高效價(jià)的抗體水平，免疫合格率仍為100%，原雞在400d時(shí)也有較高的抗體水平，但280d時(shí)免疫合格率低于70%。

孔雀H9亞型禽流感病毒抗體水平免疫接種前均低于4log2，免疫接種后14d，4種珍禽抗體水平快速升高，21d以后抗體水平緩慢下降?？兹冈诿庖呓臃N后400d時(shí)，還能維持在5log2以上較高抗體水平，免疫合格率為83.33%，而原雞、東方白鸛、斑頭雁3種珍禽在免疫接種后400d時(shí)，抗體水平還維持在5log2以上水平，免疫合格率仍為100%。

2.1.2 白冠長(zhǎng)尾雉、赤麻鴨等珍禽禽流感血清抗體效價(jià)檢測(cè) 圈養(yǎng)的白冠長(zhǎng)尾雉、雉雞、赤麻鴨、鴛鴦4種珍禽，按0.5mL／羽和1.0mL／羽分成兩組免疫注射禽流感H5N1－H9N2二價(jià)滅活苗，抗體水平較低。這4種珍禽群體禽流感H5、H9亞型抗體消長(zhǎng)規(guī)律及免疫合格率分別見表3、表4。

表2 孔雀等4種珍禽H9亞型禽流感病毒抗體值消長(zhǎng)規(guī)律及免疫合格率Table2 Immune antibody dynamics and antibody qualification rate of avian influenza virus H9antibody in 4species rare birds

表3 白冠長(zhǎng)尾雉等珍禽H5亞型禽流感病毒抗體消長(zhǎng)規(guī)律及免疫合格率Table3 Immune antibody dynamics and antibody qualification rate of avian influenza virus H5antibody in 4species rare birds

白冠長(zhǎng)尾雉等4種珍禽H5、H9亞型禽流感病毒抗體水平在免疫接種前都很低，白冠長(zhǎng)尾雉、雉雞、赤麻鴨H5亞型禽流感病毒抗體在首次免疫接種21d后升高，此后開始降低，90d時(shí)抗體水平已經(jīng)很低，而鴛鴦首次免疫接種后幾乎沒有產(chǎn)生抗體。二次加強(qiáng)免疫接種后，白冠長(zhǎng)尾雉、雉雞、赤麻鴨、鴛鴦4種珍禽在14d時(shí)抗體水平開始升高，在210d時(shí)，多數(shù)能保持較高的抗體水平，且有較高的免疫合格率。H9亞型禽流感病毒抗體水平在首次免疫接種后14d開始升高，其HI都不高，90d后，多數(shù)抗體水平降低到臨界值，在二次加強(qiáng)免疫接種后，抗體水平在14d時(shí)開始升高，24d達(dá)到高峰，在210d時(shí)，多數(shù)能維持較高的抗體水平，具有較好的免疫合格率。

2.2 免疫接種劑量試驗(yàn)

用禽流感（H5＋H9）二價(jià)滅活苗兩種劑量（1.0 mL／羽和0.5mL／羽）免疫接種動(dòng)物園圈養(yǎng)的8種珍禽后（本試驗(yàn)選用7種珍禽作對(duì)照），其飲水、采食及精神狀態(tài)均正常，無任何明顯異常反應(yīng)。

用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果表明孔雀、原雞、東方白鸛、斑頭雁兩種劑量（1.0 mL／羽和0.5mL／羽）對(duì)抗體滴度的影響差異不顯著（P＞0.05），而白冠長(zhǎng)尾雉、雉雞、赤麻鴨，1.0 mL／羽和0.5mL／羽兩種劑量在首次免疫接種后對(duì)抗體滴度的影響差異多數(shù)顯著（0.01＜P＜0.05），加強(qiáng)免疫接種后對(duì)抗體滴度的影響差異多數(shù)不顯著（P＞0.05）。H5和 H9亞型禽流感分別用1.0 mL／羽及0.5mL／羽兩種劑量免疫的抗體消長(zhǎng)規(guī)律見表5、表6。

表4 白冠長(zhǎng)尾雉等珍禽H9亞型禽流感病毒免疫抗體消長(zhǎng)規(guī)律及免疫合格率Table4 Immune antibody dynamics and antibody qualification rate of avian influenza virus H9antibody in 4species rare birds

2.3 動(dòng)物園成年珍禽禽流感免疫程序的初步建立

根據(jù)禽流感（H5＋H9）二價(jià)滅活苗免疫接種動(dòng)物園成年珍禽的抗體消長(zhǎng)規(guī)律及免疫接種劑量的比較研究，并結(jié)合動(dòng)物園的實(shí)際情況，初步建立成年珍禽禽流感預(yù)防的免疫程序：動(dòng)物園圈養(yǎng)的孔雀、原雞、東方白鸛、斑頭雁4種野生珍禽，免疫效果良好，可每年免疫接種1次；而免疫應(yīng)答差的珍禽白冠長(zhǎng)尾雉、雉雞、赤麻鴨、鴛鴦在首次免疫接種后1個(gè)月，用相同的疫苗加倍劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每半年免疫接種1次。為了確保有效的免疫保護(hù)，并結(jié)合動(dòng)物的個(gè)體情況，孔雀、原雞、東方白鸛、斑頭雁、白冠長(zhǎng)尾雉、雉雞、赤麻鴨、鴛鴦按1.0mL／羽胸部肌肉注射或頸部皮下注射H5N1－H9N2二價(jià)滅活苗。

3 討論

用禽流感H5N1－H9N2二價(jià)滅活苗免疫接種動(dòng)物園圈養(yǎng)的8種野生珍禽，大部分種類的珍禽首次免疫接種后都能同時(shí)產(chǎn)生H5和H9亞型禽流感HI抗體，但不同品種，甚至同一品種的不同個(gè)體對(duì)禽流感H5＋H9二價(jià)滅活苗的免疫反應(yīng)不同。因此，禽流感的免疫要考慮物種的差異，而且對(duì)白冠長(zhǎng)尾雉等珍禽要定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)免疫抗體水平。

H5、H9亞型禽流感病毒HI抗體的消長(zhǎng)規(guī)律基本同步。在免疫接種劑量相同的條件下，免疫接種前有基礎(chǔ)水平抗體的珍禽，免疫接種后產(chǎn)生的抗體水平比沒有基礎(chǔ)水平抗體的珍禽高。在研究過程中是以群體動(dòng)物來看禽流感HI抗體消長(zhǎng)規(guī)律的，是以禽流感病毒HI效價(jià)≥4log2判為免疫合格，但由于動(dòng)物個(gè)體的差異，群體中某些個(gè)體可能處于沒有被保護(hù)的情況，因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，為了更加的安全，在禽流感HI效價(jià)為5log2的時(shí)候就應(yīng)該加強(qiáng)免疫接種。

禽流感H5N1－H9N2二價(jià)滅活苗用于動(dòng)物園的珍禽免疫接種是安全有效的，通過研究初步確定了一個(gè)對(duì)成年珍禽的免疫程序，由于動(dòng)物園珍稀野生動(dòng)物的特殊性，品種多，數(shù)量少，研究受到局限，該免疫程序是否最佳還需做進(jìn)一步深入的研究。

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