李軍凱，楊高潮，黃 河

臨床上血栓形成、外傷、急性動脈栓塞、各種胸腹手術、取栓手術、血管重建、休克治療后、器官移植等不可避免引起器官組織血流阻斷，造成器官、組織缺血，缺血器官、組織內會有大量的氧自由基產生，動脈血流恢復后，它們隨血液循環(huán)遍布全身，而氧自由基能夠調節(jié)、控制白細胞與內皮細胞黏附因子之間的表達，促使白細胞和內皮細胞之間的黏附，從而使白細胞游出，釋放大量炎癥介質、水解酶和氧化酶等生物酶類，破壞內皮細胞[1]，使組織損傷加重。各種原因所造成的急性肢體缺血作為最常見外周血管疾病之一，死亡率高達25%，而存活者當中截肢率高達20%[2]，目前對缺血再灌注損傷沒有特別有效的方法，因此很有必要找到一種有效治療缺血再灌注損傷的藥物。

有文獻證明脈絡寧在心腦血管方面有一定的療效[3]，然而脈絡寧在肢體缺血再灌注損傷方面的治療作用鮮有報道。本研究旨在研究脈絡寧是否對肢體缺血再灌注損傷有保護作用。

1 材料及方法

1.1 實驗動物分組及模型建立 健康雄性Wistar大鼠36只，體重（210±20）g，隨機分為空白組、缺血再灌注組、脈絡寧組，每組12只。術前大鼠禁食12 h，禁水6 h，麻醉前每只大鼠給予腹腔注射脈絡寧1mL，空白組和缺血再灌注組腹腔注射同等劑量生理鹽水。采用烏拉坦（40 mg/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉滿意后15 min后行腹部正中切口，進入腹腔，剪開后腹膜，鈍性分離出腹主動脈，在髂總動脈分叉處上方0.5 cm處，用無創(chuàng)動脈夾夾閉腹主動脈，以阻斷平面以下管腔變扁平及動脈搏動消失為缺血造模成功，關腹。2 h后開腹，取下血管夾，血管夾處以下腹主動脈有搏動后關腹腔，恢復腹主動脈血流4 h，空白組步驟基本同缺血再灌注組，但不做腹主動脈阻斷。

1.2 藥物與試劑 脈絡寧，金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，批準文號：國藥準字Z32021102。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 檢測項目和標本制作

1.3.1 血清SOD、MDA的測定 各組大鼠于再灌注4 h后從下腔靜脈采血2mL，以3 000 r/min離心10 min后取血清，裝入EP管中，－40℃凍存?zhèn)溆谩DA的檢測采用硫代巴比妥酸法（TBA法），SOD的檢測采用黃嘌呤氧化酶法。

1.3.2 制作石蠟切片與光鏡觀察 采血結束時迅速取大鼠后肢腓腸肌組織，常規(guī)HE染色。

1.4 統(tǒng)計學處理 所得實驗數據用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行分析，統(tǒng)計描述用均數±標準差（±s）表示，各組數據均服從正態(tài)分布，進行方差齊性檢驗，采用單因素方差分析的單向分類的方差分析（One－Way ANOVA）及LSD檢驗。

2 結 果

2.1 脈絡寧對血清SOD活性和MDA含量的影響 缺血再灌注組與空白組比較，血清SOD活性降低（P＜0.05），MDA含量增多（P＜0.05）。脈絡寧組與缺血再灌注組比較，血清SOD活性升高（P＜0.05），MDA含量減少（P＜0.05）。脈絡寧組與空白組比較各指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 不同組別血清SOD和MDA值比較（±s）

表1 不同組別血清SOD和MDA值比較（±s）

與空白組比較，1）P＜0.05；與缺血再灌注組比較，2）P＜0.05

組別 n SOD（U/mL） MDA（nmol/mL）12 253.68±22.97 6.79±2.24缺血再灌注組 12 221.01±20.951） 12.25±1.981）脈絡寧組 12 243.56±23.702） 10.06±3.032）空白組

2.2 各組大鼠骨骼肌病理改變 光鏡下觀察大鼠腓腸肌形態(tài)改變：空白組縱切面上肌纖維染色均勻，橫紋清晰，肌纖維未見壞死及炎細胞浸潤；缺血再灌注組縱切面上肌纖維體積增大，染色變淡，有不同程度腫脹，可見空泡，可見部分橫紋；脈絡寧組肌纖維腫脹減輕，空泡基本消失，橫紋結構恢復。

3 討 論

缺血再灌注損傷的研究歷來備受臨床工作者尤其是外科醫(yī)生的重視，隨著介入技術的發(fā)展，醫(yī)源性血管創(chuàng)傷的并發(fā)癥相對增多，然而，眾所周知，減輕此類損傷最有效的辦法是盡量縮短缺血時間，在實際工作當中，部分治療的缺血時間不好控制，從而導致一些患者因缺血時間過長喪失治療機會，一些患者因術后血流動力學改變而治療失敗，增加了此類損傷的致死率和致殘率。防治肢體再灌注損傷，設法減輕肌肉缺血損傷的程度，對挽救肢體，降低截肢率，恢復肢體功能具有很重要的意義，因此在盡量縮短缺血時間的同時，能找到一種有效輔助治療缺血再灌注損傷肢體的藥物很有必要。

本實驗中缺血再灌注組與空白組相比，SOD活性下降（P＜0.05），MDA含量增加（P＜0.05）；脈絡寧組與缺血再灌注組相比，SOD活性升高但低于空白組，MDA含量比缺血再灌注組低，但高于空白組；脈絡寧組和空白組SOD活性及MDA含量相比無統(tǒng)計學意義。這說明在生理狀態(tài)下，機體內能夠產生少量的氧自由基，它們在維持細胞正常生理活動，如：內環(huán)境穩(wěn)定、有絲分裂和細胞信號轉導，發(fā)揮著重要作用，并且與自由基清除劑能保持動態(tài)平衡，肢體缺血再灌注后，大量氧自由基釋放，進入血液，消耗體內的抗氧化酶超氧化物歧化酶，導致氧化－抗氧化系統(tǒng)失衡大量氧自由基釋放入血，引起MDA升高，但是缺血再灌注產生大量氧自由基會對機體造成嚴重損傷[4]。大量氧自由基能夠氧化細胞膜中的脂質，使細胞膜的正常結構遭到破壞，進而增加其通透性，使細胞膜破裂，最終產生更多的氧自由基。SOD是清除氧自由基的專一歧化酶，可以反映體內的抗氧自由基能力，丙二醛是氧自由基攻擊生物膜的不飽和脂肪酸所形成的脂質過氧化物，反映機體脂質過氧化程度，間接反映組織內氧自由基水平。一旦脂質氧化被引發(fā)，則可呈級聯反應，進一步擴散和放大。再Park等[5]通過在制作的大鼠提睪肌皮瓣的缺血再灌注的模型研究中發(fā)現，SOD可以清除組織器官中產生的多余氧自由基，使黏附分子的表達受到抑制，減少炎癥細胞在骨骼肌的聚集，保護肢體免受缺血再灌注損傷。用藥后SOD含量升高，MDA含量降低，說明脈絡寧能提高SOD含量，增強其活力，與此同時減弱機體脂質過氧化程度，減輕細胞損傷程度，達到保護缺血再灌注損傷肢體的作用。

病理切片結果顯示，與空白組比較，缺血再灌注組骨骼肌纖維水腫；其作用機制可能是：組織缺血后首先發(fā)生的病理變化是水腫，因為線粒體受損時ATP的生成量減少，Na泵功能障礙會導致細胞內鈉離子和水的過多蓄積，之后機體產生大量氧自由基，炎性介質，無機磷酸鹽，乳酸和嘌呤核苷酸等代謝產物，它們的蓄積可增加滲透壓負荷，進一步加重組織損傷；加重組織損傷的重要因素之一是炎癥反應，炎癥反應的關鍵步驟是中性粒細胞的激活、移行、邊附及在血管外周組織中大量聚集，它在肢體缺血再灌注損傷時期起著關鍵作用[6]，最終使血管壁的通透性增大，組織水腫。與缺血再灌注組比較，脈絡寧組骨骼肌纖維水腫減輕，部分肌纖維接近正常，這說明脈絡寧可以減輕組織水腫，能顯著保護缺血再灌注時骨骼肌細胞SOD的活力，減少MDA的生成量，保護骨骼肌細胞膜結構和功能的完整性，對肢體缺血再灌注損傷有明顯的保護作用。此作用可能與以下兩方面有關：一方面脈絡寧具有活血化瘀、增加血流量、增加毛細血管開放，改善機體微循環(huán)、降低氧耗、改善肌細胞代謝等作用，能夠保護機體內源性SOD活力，減輕過量蓄積的氧自由基對缺血再灌注損傷骨骼肌細胞膜脂質過氧化的損傷程度[6]；另一方面可能是脈絡寧的物理作用，通過藥物的滲透作用，減少水進入細胞內，并將水從細胞內轉移到細胞外，進而維持細胞的正常容積，防止細胞及其細胞器破裂，起到減輕細胞水腫的作用。

缺血再灌注損傷涉及的病理過程十分復雜，它是一個多因素參與，多機制共同作用的結果，能引起許多免疫組織、器官病理生理過程的改變，比如血管內皮細胞功能障礙，無復流現象，毛細血管通透性改變，中性粒細胞浸潤，自由基產物過多堆積，缺氧和微循環(huán)改變等[7－10]。而這些病理改變如果得不到及時改善，將引起以下變化：動脈血流的恢復會引起細胞發(fā)生級聯反應以及機體全身的生化反應，從而導致缺血再灌注肌肉的水腫、壞死以及結構破壞，最終使其功能受損，嚴重時不僅引起缺血器官組織本身受損，甚至會引起機體其他器官如肝、腎、肺等遠隔器官的結構、功能損害[11]，甚至引發(fā)全身炎癥反應綜合征（SIRS），給機體造成不可逆損傷。肢體缺血再灌注損傷所導致的大量紅細胞、血小板聚集，白細胞黏著附壁、白色微血栓的形成等均可，減慢血液流動速度，減少組織器官氧供，而缺氧、血液黏稠度的增高、血液流動速度的減慢又可進一步促進紅細胞聚集、血小板白色微栓形成[12]。這種惡性循環(huán)可解釋再灌注后隨時間的推移，微循環(huán)障礙逐漸加重。而脈絡寧毒副反應小，作用溫和，通過多種途徑來改善血液流變，擴張血管，降低血管阻力，增加毛細血管開放率，促進側支循環(huán)的建立，增加局部血流，改善血液流變性，改善微循環(huán)，提高組織和器官抗缺血、缺氧能力，從而降低氧耗，改善細胞代謝，以對抗肢體缺血產生氧自由基的損傷作用；另外通過改善全血粘度，增加纖溶酶原水平，改善機體的凝血機制，提高組織型纖溶酶原激活物活性，降低纖維蛋白原含量，抑制血小板聚集，清除機體過多自由基等保護動脈內皮細胞，解除血管痙攣和抗凝血的作用，可以防止血栓形成[13]，起到保護缺血再灌注損傷肢體的作用。本實驗研究結果表明，脈絡寧對缺血再灌注損傷的肢體有保護作用。

[1] 胡國富，金畢夏.佛伐他汀對下肢缺血再灌注損傷的保護作用[J].華中醫(yī)學雜志，2007，31（3）：170.

[2] Dick F，Li J，Giraud MN，et al.Basic control of reperfusion effectively protects against reperfusion injury in a realistic rodent model of acute limb ischemia[J].Circulation，2008，118（19）：1920－1928.

[3] 陳藍，王蔚，王選，等.脈絡寧治療缺血性腦血管病的臨床療效的Meta分析[J].中風與神經疾病雜志，2010，27（4）：313－316.

[4] 孫海波，魏俊強.骨骼肌缺血再灌注損傷中自由基的產生機制及治療研究進展[J].中國矯形外科雜志，2011，19（4）：305.

[5] Park JW，Qi WN，Cai Y，et al.Skeletal muscle reperfusion injury is enhanced in extracellular superoxide dismutase knockout mouse[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，1：181－187.

[6] 王岱君，王金平，鞠學紅，等.脈絡寧對兔肢體缺血再灌注損傷的防護作用[J].中華創(chuàng)傷雜志，2004，20（4）：237.

[7] Nadaud S，Philippe M，Amal JF，et al.Sustained increase in aortic endothelial nitric oxide synthase expression in vivo in a model of chronic high blood flow[J].Circ Res，1996，79（4）：857－886.

[8] Thiagarajan RR，Winn RK，Hadan JM.The role of leukocyte and endothelial adhesion molecules in ischemia reperfusion injury[J].Thromb Haemost，1997，78（1）：310－314.

[9] Crinnion JN，Homer－Vanniasinkam S，Parkin SM，et al.Role of neutrophil－endothelial adhesion in skeletal muscle reperfusion injury[J].Br J Surg，1996，83（2）：251－254.

[10] Allen DM，Chen LE，Seaber AV，et al.Pathophysiology and related studies of the no reflow phenomenon in skeletal muscle[J].Clin Odhop Relat Res，1995（314）：122－133.

[11] Kearns SR，Monnoley D，Murray P，et al.Oral vitamin C attenuat es acute ischaemia reperfusion injury in skeletal[J].J Bone Joint Surg Br，2001，83（8）：1202.

[12] 范里，杜飛，劉世清，等.丹參對肢體缺血再灌注損傷保護的實驗研究[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2003，11（5）：11.

[13] 吳雙貴，談發(fā)金.注射用脈絡寧注射液活血化瘀作用的實驗研究[J].湖南中醫(yī)雜志，2009，25（3）：113.