李和平 李惠勉

(鄭州大學第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450014)

腦缺血再灌注損傷的機制是一個復雜的病理級聯(lián)反應過程。尋找一種抑制再灌注損傷的腦保護藥已成為醫(yī)學界的焦點。王巖等〔1〕認為吲哚美辛對大腦有保護作用，但是作用機制臨床研究較少，本實驗通過運用大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，觀察吲哚美辛預處理后對腦缺血再灌注損傷后腦組織海馬區(qū)中白介素IL-1β和C反應蛋白(CRP)的影響，探討其腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年雄性SD大鼠84只，體質量(300±50)g，由鄭州大學實驗動物中心提供;吲哚美辛片，由河南開封市永康藥業(yè)有限公司提供;免疫組化試劑盒購自RD公司，國內分裝。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 將大鼠隨機分為假手術組(28只)、模型組(28只)、吲哚美辛預處理組(28只)，每組于缺血后再灌注6、12、24、48 h又分為4個亞組，每組7只。

1.2.2 給藥 吲哚美辛預處理組術給予吲哚美辛水溶片(5 mg/kg)混懸液灌胃，1次/d連續(xù)3 d，根據(jù)體重計算吲哚美辛用量;假手術組和模型組均給予同等劑量生理鹽水灌胃。

1.2.3 模型制備 大鼠造模前禁食水8 h，稱重后用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術臺。根據(jù)改良Longa的線栓法，制作左側大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型，其成功的標準采用Longa神經(jīng)功能評分法，按神經(jīng)缺損輕重分為5級:神經(jīng)功能正常為0級;不能伸展右側前肢為1級;向右側旋轉為2級;向右側傾倒為3級;無自主活動伴意識喪失4級。0級和4級的被淘汰，1～3級的入選實驗組，各亞組不成功者由替補組補充。

1.2.4 標本制備 模型成立后，將大鼠于各相應時間點麻醉后斷頭取腦，于4%多聚甲醛液中24 h后固定，并做組織切片，片厚約6～7μm。每組均取海馬區(qū)組織切片做HE染色，并采用免疫組織化S-P法染色且進行DAB顯色，對組織標本免疫組化結果進行定量測定，步驟按免疫組化試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用x±s表示，使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件計算，組間比較采用單因素方差分析

2 結果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分 假手術組神經(jīng)功能均正常;模型組神經(jīng)功能缺損最重，各時間點缺損評分與假手術組比較有顯著性差異(P＜0.05);吲哚美辛預處理組神經(jīng)功能缺失評分降低，各時間點與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

2.2 腦組織病理特點 大體觀察，模型組與假手術組大鼠病灶腦組織的腫脹最為明顯，而吲哚美辛預處理組與模型組相比較，腦組織水腫有不同程度的減輕。HE染色后光鏡觀察:假手術組腦海馬區(qū)神經(jīng)細胞輪廓清晰，排列整齊，細胞核大且圓，著色較淺，細胞核多于細胞中央，偶可見嗜酸性核仁;模型組神經(jīng)細胞輪廓模糊，排列紊亂，胞核小、著色變深，胞質分界不清;吲哚美辛預處理組神經(jīng)細胞結構尚清晰，胞核與胞質尚能分清，提示吲哚美辛起到了神經(jīng)保護作用。

2.3 免疫組化染色結果 IL-1β和CRP于假手術組均可見極少量陽性細胞表達，缺血再灌注6 h后兩者的表達開始增高，于24 h達高峰，48 h開始下降，各時間點與假手術組比較均明顯增高(P＜0.05);吲哚美辛預處理組各時間點與模型組相比，兩者的表達都明顯減少(P＜0.05)。見表2，表3。

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺失評分(x ± s，n=7)

表2 各組大鼠不同時間點CRP的表達(x ± s，n=7)

表3 各組大鼠不同時間點IL-1β的表達(x ± s，n=7)

3 討論

近年來研究認為腦缺血再灌注損傷機制主要與炎癥反應、氧自由基形成、細胞內鈣超載、興奮性氨基酸的毒性作用、一氧化氮(NO)的過多釋放、細胞凋亡等因素有關〔2〕，以上因素之間又相互聯(lián)系，并共同作用參與腦缺血再灌注損傷的過程，其中炎癥反應是腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展十分重要的環(huán)節(jié)。

研究表明腦缺血誘導白細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞和內皮細胞等釋放炎性細胞因子如IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)，黏附因子、血小板活化因子(PAF)和一些炎癥介質如前列腺素和NO等〔3〕，這些炎性因子的生成是造成缺血損傷向炎癥損傷發(fā)生的基礎，同時這些炎性因子可激活白細胞黏附到腦缺血區(qū)微血管內皮細胞上，造成內皮細胞的皺縮、壞死，破壞血-腦脊液屏障(BBB)，加重腦缺血再灌注區(qū)的損傷。此外，在腦缺血再灌注時，細胞因子IL-1β等又可以促進趨化因子和黏附因子的上調，促使白細胞與內皮細胞的黏附進一步加強，從而形成級聯(lián)炎癥反應。Vila等〔4〕研究表明IL-1β是缺血再灌注損傷后較早表達的炎癥細胞因子之一，腦缺血發(fā)生后24 h內，就可以在患者的腦脊液和血清中顯著升高，且與病情嚴重程度呈正相關。IL-1β主要存在于腦組織中，具有多方面生物學功能，在正常的腦組織中表達很少，而缺血再灌注時則明顯升高。導致?lián)p傷的機制主要為:增加興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性;增加神經(jīng)細胞鈣離子超負載，加速神經(jīng)細胞死亡;刺激其他多種炎癥因子及炎癥介質的釋放;誘導神經(jīng)元基因的表達，促使細胞凋亡。本結果表明IL-1β在腦缺血再灌注后腦組織局部炎癥反應起關鍵作用。

臨床研究業(yè)已證明，CRP可以認為是炎癥反應等引起的急性非特異性敏感標志物，CRP水平的高低與腦缺血再灌注損傷的炎癥反應及預后呈正相關〔5，6〕。而 Mueller 等〔7〕研究表明CRP不僅直接參與炎癥反應的過程，并且可作為評估指標來反映炎癥的程度。Peps等〔8〕研究顯示在急性炎癥反應6～8 h內CRP迅速升高，可達到正常水平的幾百倍甚至更高，并在48～72 h達到高峰，隨著炎癥反應的減輕，CRP也降低。本實驗結果和其基本一致CRP可敏感地反映缺血再灌后的炎癥反應動態(tài)變化。同時Peps等〔8〕研究認為CRP導致腦缺血再灌注損傷的機制可能為:活化自身受體;激活補體系統(tǒng);誘導黏附分子、單核細胞組織因子及內皮細胞的表達;激活炎性細胞因子IL-1β等的釋放。

Hartl等〔9〕認為通過干預炎癥反應的發(fā)生發(fā)展過程，就能降低腦缺血再灌注腦損傷的進程。吲哚美辛為非甾體抗炎藥，具有很強的抗炎作用，臨床主要用來治療關節(jié)炎，偏頭痛等，其作用機制為抑制環(huán)氧合酶活性而減少前列腺素的合成，抑制炎性反應，制止炎癥組織痛覺神經(jīng)沖動的形成，并且抑制溶酶體酶的釋放和白細胞的趨化作用等。本實驗結果說明炎性反應參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程;而預先給予吲哚美辛干預后，大鼠神經(jīng)缺損評分減低，腦水腫減輕，IL-1β，CRP明顯降低，提示吲哚美辛具有一定腦保護作用，其機制可能是通過抑制缺血再灌注區(qū)腦組織中炎癥因子IL-1β、CRP的表達有關，為吲哚美辛治療腦缺血再灌注損傷提供理論支持。

1 王 巖，閆麗儒，呂蔓華，等.吲哚美辛對腦梗死急性期炎癥反應的影響〔J〕.中風與神經(jīng)疾病雜志，2010;1227(12):1079-81.

2 夏 強，錢令波.心腦缺血再灌注損傷的機制及防治策略研究進展〔J〕.浙江大學學報:醫(yī)學版，2010;39(6):551-8.

3 Huang J，Upadhyay UM，Tamargo RJ.Inflammation in stroke and focal cerebral ischemia〔J〕.Surg Neurol，2006;66(3):232-45.

4 Vila N，Castillo J，Davalos A，et al.Proinflammatory cytokines and early neurological worsening in ischemic stroke〔J〕.Stroke，2000;31(10):2325.

5 Di Nopoli M，Di Gianfilippa G，Sollecito A，et al.C-reactive protein and outcome after first ischemic stroke〔J〕.Stroke，2000;31(1):238-9.

6 Sepulveda JL，Mehta JL.C-reactive protein and cardiovascular disease:a critical appraisal〔J〕.Curr Opin Cardial，2005;20(5):408-16.

7 Mueller C，Buettner H，Hodgon JM，et al.Inflammation and a long term mortality after non-ST elevation acute coronary syndrome treated with a very invasive strategy in 1042 consecutive patients〔J〕.Circulation，2002;105:1412.

8 Peps MB，Hirschfield GM.C-reactive protein:a critical up-date〔J〕.Clin Invest，2003;111(12):1805-12.

9 Hartl R，Schurer L，Schmid-schonbein GW，et al.Experimental antileukocyte interventions in cerebral ischemia〔J〕.Cere Blood Flow Metab，1996;16(6):1108-10.