董曉麗 明海霞 金 戈

(甘肅中醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，蘭州 甘肅 730000)

肌肽是繼超氧化物歧化酶(SOD)和維生素E后又一被發(fā)現(xiàn)的天然非酶促自由基清除劑和抗氧化劑〔1〕。本研究用H2O2處理PC12細(xì)胞，制備氧化應(yīng)激損傷致凋亡的模型，采用MTT法檢測肌肽對PC12細(xì)胞增殖的影響，觀察肌肽是否具有抗氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)作用;檢測肌肽對凋亡相關(guān)基因NF-κB P65 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠腎上嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)購于上海中科院生物細(xì)胞所;引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)〔2〕，委托上海生工合成。L-肌肽購自吉爾生化(上海)有限公司、UNIQ-10 Trizol總RNA抽提試劑盒和AMV一步法RT-PCR試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;小鼠抗大鼠NF-κB P65單克隆抗體、SABC、DAB試劑盒等購自武漢博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞經(jīng)常規(guī)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用DMEM培養(yǎng)液，含10%熱滅活超級新生牛血清、1%谷氨酰胺、青鏈霉素(100 U/ml)。37℃、5%CO2，飽和濕度下恒溫培養(yǎng)箱中貼壁生長，每3天換液1次，1 w傳代1次。

1.2.2 MTT比色法檢測PC12細(xì)胞的增殖 取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按照1×104個/ml的密度接種于96孔板中，每組6孔，37℃孵育過夜后，棄去原培養(yǎng)液，正常組加入 DMEM完全培養(yǎng)基 100μl，損傷組加入終濃度為200μmol/L的H2O2，保護(hù)組加入H2O2前30 min加入肌肽，使肌肽終濃度分別為10，20，30 mmol/L。37℃孵育16 h，棄去藥液和培養(yǎng)液，每孔加入MTT 25μl，繼續(xù)孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μl，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫分析儀490 nm波長檢測各孔光密度(OD)值，并計(jì)算生長抑制率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇肌肽作用PC12細(xì)胞的最佳濃度。

1.2.3 RT-PCR檢測NF-κB P65 mRNA的表達(dá) 將所需離心管、PCR反應(yīng)管和微量吸頭在0.1%EPC溶液中浸泡24 h，烤干后高壓滅菌備用。RNA抽提按照UN IQ210 Trizol總RNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行。RT-PCR引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)〔2〕:擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物493 bp。RT-PCR反應(yīng)按試劑盒說明操作。擴(kuò)增產(chǎn)物保存于4℃冰箱，取擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 SABC免疫酶染色法測定NF-κB P65蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先放置6 mm×22 mm蓋玻片的六孔板中，培養(yǎng)過夜。棄原培養(yǎng)液，設(shè)正常對照組、損傷組(加入終濃度為200μmol/L的H2O2)、保護(hù)組(加入H2O2前30 min加入肌肽終濃度為20 mmol/L)和空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)16 h，取出蓋玻片，按照SABC試劑盒說明書操作。

1.2.5 Annexin V2FITC和PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×106個/ml接種于T250培養(yǎng)瓶中，設(shè)正常對照組、損傷組、保護(hù)組(加入H2O2前30 min加入肌肽終濃度為20 mmol/L)和空白對照組，培養(yǎng)24 h，棄液，加入DMEM繼續(xù)培養(yǎng)16 h，用PBS重懸細(xì)胞，離心5 min，棄上清，重復(fù)2次，將細(xì)胞重懸于200μl結(jié)合緩沖液。加入10μl Annexin V2FITC和5μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300μl結(jié)合緩沖液，立即上機(jī)檢測。記錄激發(fā)光波波長為488 nm處的熒光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均用x±s表示，采用SPSS10.0軟件包處理，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肌肽對過氧化氫的毒性有保護(hù)作用 培養(yǎng)的PC12細(xì)胞用不同的劑量(10～30 mmol/L)的肌肽預(yù)處理30 min，加入200μmol/L的H2O2，PC12細(xì)胞的存活率隨肌肽劑量的增大而升高，具有明顯的量效依賴性。20 mmol/L達(dá)最大值。見表1。

2.2 肌肽對NF-κB P65基因mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，用20 mmol/L的肌肽預(yù)處理PC12細(xì)胞，再用H2O2處理細(xì)胞后，NF-κB P65 PCR產(chǎn)物的條帶變淡，說明肌肽作用于PC12細(xì)胞后，其NF-κB P65基因mRNA的表達(dá)下降。

2.3 肌肽對NF-κB P65蛋白的表達(dá)的影響 免疫組化SABC法表明肌肽可降低由H2O2導(dǎo)致的NF-κB P65蛋白表達(dá)。保護(hù)組NF-κB P65蛋白表達(dá)為26.3%，較損傷組(39.1%)明顯降低(P＜0.05)，與正常組(11.8%)比較(P＜0.01)，陽性細(xì)胞數(shù)增多，陽性著色加深，或見顆粒樣物質(zhì)。

表1 L-肌肽對H 2 O2抑制PC12細(xì)胞增殖的影響(x ± s，n=6)

3 討論

近年研究表明活性氧和氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病中起著重要的作用〔3〕。神經(jīng)組織中含有大量易被氧化的不飽和脂肪酸以及低水平的抗氧化物質(zhì)，使其更易受到活性氧的損傷〔4〕。H2O2是一種活性氧成分，它參與了許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制。常用作神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的誘導(dǎo)劑。PC12細(xì)胞在神經(jīng)生長因子的作用下能夠分化獲得神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)型，具有神經(jīng)細(xì)胞的一般生物學(xué)特征，能穩(wěn)定傳代，可以作為神經(jīng)細(xì)胞的體外模型。H2O2可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷凋亡〔5〕，其機(jī)制包括誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因Caspase-3和NF-κB P65的表達(dá)和胱天蛋白酶Caspase的活化等〔6〕。目前，肌肽已作為抗衰老、抗白內(nèi)障藥物應(yīng)用于臨床。最近，又有學(xué)者提出了肌肽有抗凋亡的作用〔7〕。氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡又是AD的重要機(jī)制之一，肌肽的神經(jīng)保護(hù)是否與抗凋亡有關(guān)呢?這正是本實(shí)驗(yàn)的立題依據(jù)所在。NF-κB是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，它分布廣泛并調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的生理病理過程。曲喜英等〔6〕H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡結(jié)果也表明，H2O2濃度增大NF-κB P65mRNA及蛋白表達(dá)水平增加。Boehrer等〔8〕研究證實(shí)Aβ可激活培養(yǎng)神經(jīng)元內(nèi)NF-κB的表達(dá)，認(rèn)為NF-κB在AD發(fā)病機(jī)制中起重要作用。Del Rio等〔9〕用多巴胺誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)現(xiàn)NF-κB、P53和c-lun轉(zhuǎn)錄因子都被激活。本研究證實(shí)肌肽具有神經(jīng)保護(hù)作用。有研究表明，NF-κB P65激活可以使細(xì)胞編碼的抗凋亡蛋白迅速下降，包括Bcl-2、鈣結(jié)合蛋白及凋亡蛋白的抑制因子;促凋亡蛋白上升，如P53、Par-4等。本研究結(jié)果表明NF-κB P65可能參與了H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程，肌肽能抑制PC12細(xì)胞的凋亡，機(jī)制可能是通過抑制NF-κB P65基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

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6 曲喜英，張海風(fēng)，祝其峰.H2O2對 PC12細(xì)胞 Caspase-3和 NF-κB P65基因表達(dá)的影響〔J〕.武漢大學(xué)學(xué)報，2005;26(1):17-20.

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