邱 樂 王新生 劉 擎

(解放軍458醫(yī)院，廣東 廣州 510602)

中風(fēng)分為出血性中風(fēng)和缺血性中風(fēng)。在我國，約85%的缺血性中風(fēng)急性發(fā)作(acute ischemic stroke，AIS)具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高以及并發(fā)癥多的特點(diǎn)。有研究表明AIS患者氣虛血瘀證達(dá)73%，故益氣活血法是AIS的重要治療方法，尤以黃芪注射液和燈盞細(xì)辛注射液為臨床常用藥物。本研究通過復(fù)制AIS大鼠模型，研究黃芪注射液和燈盞細(xì)辛注射液對(duì)改善AIS大鼠微循環(huán)的作用機(jī)制，為指導(dǎo)AIS的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康老年SD大鼠60只，體質(zhì)量(270±30)g(廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。治療用藥:①黃芪注射液〔10 ml/支(相當(dāng)于原藥材20 g)，國藥準(zhǔn)字Z33020179，正大青春寶藥業(yè)有限公司〕;②燈盞細(xì)辛注射液(10 ml/支，國藥準(zhǔn)字Z53021569，云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將60只SD大鼠隨機(jī)取15只做假手術(shù)組;余行AIS模型制備，術(shù)后45只隨機(jī)取15只做模型組，余30只為治療組。

1.2.2 模型制作 采用多因素復(fù)合方法復(fù)制氣虛血瘀證動(dòng)物模型，頸總動(dòng)脈結(jié)扎并改良線栓法復(fù)制腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

1.2.2.1 氣虛血瘀模型 參照文獻(xiàn)〔1〕，采用饑餓、冷水疲勞游泳結(jié)合高脂飲食的方法造模。①饑餓:先測得大鼠正常飲食量，僅按正常飲食量60%喂養(yǎng)。②冷水疲勞游泳:將大鼠每日于水溫(10±0.2)℃、深30 cm水桶中，棒打促使其持續(xù)游泳，至疲勞開始下沉?xí)r撈出，自然風(fēng)干，不采取保暖措施。③高脂飲食:上述步驟處理后，再予脂肪乳灌胃，劑量按大鼠體重系數(shù)折算，予10 ml/kg灌胃，1次/d。以上方法持續(xù)7 d。造模成功標(biāo)準(zhǔn):精神萎靡，倦怠嗜睡，毛發(fā)無光澤或結(jié)穗或稀疏脫落，稀便，舌淡或紫暗，眼球暗紅，四肢或尾部出現(xiàn)瘀點(diǎn)瘀斑等。

1.2.2.2 大鼠局灶性腦梗死模型 參照文獻(xiàn)〔2，3〕，采用頸總動(dòng)脈結(jié)扎并改良線栓法造模。所有造模大鼠術(shù)前均禁食1 d，予腹腔內(nèi)注射20%烏拉坦(900 mg/kg)麻醉，仰臥位固定大鼠，頸部常規(guī)備皮消毒后，沿頸部正中切開，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露并分離右側(cè)頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)，于近頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈。夾閉頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。近頸總動(dòng)脈分叉約5 mm處針刺破入并將栓線插入頸總動(dòng)脈，松開微動(dòng)脈夾，將插線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，進(jìn)線深度(19±0.5)mm。將栓線與頸總動(dòng)脈結(jié)扎固定，消毒術(shù)區(qū)，縫合筋膜、皮膚。外用甲硝唑粉預(yù)防感染。假手術(shù)組除不插栓線外，其余手術(shù)步驟同模型組。造模成功的標(biāo)準(zhǔn):蘇醒后左上肢屈曲，行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)或左側(cè)肢體癱瘓，或伴右側(cè)Horner征。不符合標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物剔除。

1.2.3 給藥方法 各組大鼠均于造模成功10 min后給藥，劑量參考人與大鼠體重系數(shù)折算標(biāo)準(zhǔn)〔4〕。治療組予以腹腔注射黃芪注射液(3.2 ml/kg)及燈盞細(xì)辛注射液(3.6 mg/kg)，假手術(shù)組與模型組腹腔注射等量生理鹽水;每日1次，療程4 d。室溫下飼養(yǎng)，自由飲食飲水，自然晝夜。

1.2.4 觀察指標(biāo) 各組大鼠分別于治療前后檢測血管內(nèi)皮素(ET)、5-羥色胺(5-HT)、D-D 二聚體(D-Dimer，D-D)、血栓烷素A2(TXA2)、前列環(huán)素(PGI2)、熱休克蛋白70(HSP70)mRNA;并在治療 0、12、24、48、72、96 h 分別作大鼠神經(jīng)功能 ZeaLonga評(píng)分。

1.2.4.1 大鼠神經(jīng)功能ZeaLonga評(píng)分〔1〕①無神經(jīng)功能缺失癥狀，活動(dòng)正常(0分);②不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪(1分);③動(dòng)物爬行時(shí)出現(xiàn)向左轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象)(2分);④身體向偏癱側(cè)傾倒(3分);⑤不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失(4分)。分別剔除評(píng)分為0分和4分者。

1.2.4.2 檢測方法 運(yùn)用放射免疫法測定血漿 ET、TXA2、PGI2水平，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿D-D水平，以RF-510型熒光分光光度計(jì)測定大腦皮層5-HT水平，用Northern印跡檢測腦組織HSP70 mRNA水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);神經(jīng)功能缺損評(píng)分采用重復(fù)測量資料的方差分析;各微循環(huán)指標(biāo)治療前后比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能ZeaLonga評(píng)分 模型組96 h評(píng)分與同組12 h評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，治療組72、96 h評(píng)分與同組24 h評(píng)分，治療組96 h與同組48 h評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);且治療組 24、48、72、96 h評(píng)分與模型組同一時(shí)點(diǎn)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 微循環(huán)指標(biāo) (1)各組內(nèi)比較:模型組治療后的5-HT、TXA2、HSP70 mRNA水平與治療前比較均有顯著差異(P＜0.05)，表明AIS部分微循環(huán)指標(biāo)可于發(fā)病4 d內(nèi)的非治療狀態(tài)下自行緩解;治療組治療后的各指標(biāo)水平與治療前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明益氣活血法對(duì)AIS各微循環(huán)指標(biāo)均有不同程度的改善作用。(2)各組間比較:治療前的假手術(shù)組各指標(biāo)水平與模型組、治療組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明所選大鼠造模成功后AIS微循環(huán)障礙的各指標(biāo)均有不同程度惡化;治療后治療組的ET、D-D、TXA2、HSP70 mRNA水平與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明益氣活血法對(duì)AIS部分微循環(huán)指標(biāo)的改善優(yōu)于其自行緩解;治療后的治療組D-D水平與假手術(shù)組無顯著差異(P＞0.05)，表明益氣活血法治療后，D-D水平可改善至近似發(fā)病前的正常水平。見表2。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能ZeaLonga評(píng)分比較(x±s)

表2 治療前后各組微循環(huán)指標(biāo)比較(x±s)

3 討論

AIS腦損傷的主要機(jī)制為興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷，而微循環(huán)損傷是其核心之一。ET、5-HT、D-D、TXA2、PGI2、HSP70 mRNA為反映微循環(huán)障礙及由此引起神經(jīng)元損傷的重要指標(biāo)。

AIS的缺氧和機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)能迅速誘導(dǎo)腦組織ET高表達(dá)，導(dǎo)致腦微循環(huán)功能紊亂及由此所致的神經(jīng)元損傷。ET一方面可致腦血管強(qiáng)烈收縮痙攣，腦血流量急劇下降而致腦組織缺血缺氧，導(dǎo)致和加重腦缺血再灌注損傷;另一方面對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，加劇腦水腫的發(fā)生發(fā)展，造成腦組織的嚴(yán)重?fù)p傷〔5〕。

5-HT為內(nèi)源性的血管活性因子，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，具有重要的血管活性作用〔6〕。缺血性腦損傷的單胺遞質(zhì)假說認(rèn)為:①腦缺血可致細(xì)胞外5-HT濃度迅速升高。有研究發(fā)現(xiàn)全腦缺血后多個(gè)腦區(qū)均存在單胺類遞質(zhì)紊亂，進(jìn)一步揭示了單胺類遞質(zhì)與腦缺血損傷之間的密切聯(lián)系。②腦缺血時(shí)血小板活性增高，釋放功能增強(qiáng)，也可致5-HT升高。③5-HT可通過直接興奮血管平滑肌的5-HT2受體，增強(qiáng)其他內(nèi)源性縮血管物質(zhì)作用以及促進(jìn)腎上腺能神經(jīng)元末梢釋放去甲腎上腺素而使腦血管收縮，加重腦組織缺血損傷。

D-D是交聯(lián)纖維蛋白在纖溶酶作用下產(chǎn)生的一種特異性的最終降解產(chǎn)物。D-D升高表明血栓形成和溶解均增強(qiáng)，高水平D-D可預(yù)示缺血性腦血管疾病的發(fā)生。凝血酶水解纖維蛋白原產(chǎn)生可溶性纖維蛋白單體(SFM)，進(jìn)而形成具有穩(wěn)定、堅(jiān)固、不再溶解特點(diǎn)的交聯(lián)纖維蛋白，故而凝血;纖維凝血6 h后血栓即發(fā)生繼發(fā)性纖維蛋白溶解，纖溶酶降解纖維蛋白原、SFM及關(guān)聯(lián)纖維蛋白，D-D就是其中一種降解產(chǎn)物。D-D增高提示繼發(fā)性纖溶活性增強(qiáng)，可作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的特異性血液學(xué)分子標(biāo)記物〔7〕。

TXA2和PGI2為調(diào)節(jié)血管張力的一對(duì)天然的拮抗物，都具有重要的血管活性作用。TXA2是由血小板微粒體合成并釋放的一種具有強(qiáng)烈促進(jìn)血管收縮和血小板聚集的生物活性物質(zhì)，PGI2是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放的一種具有抗血小板聚集和舒張血管的生物活性物質(zhì)。正常情況下，二者在腦組織內(nèi)保持動(dòng)態(tài)平衡，以維持腦血管穩(wěn)定和血流通暢。腦缺血時(shí)，Ca2+超載致花生四烯酸(AA)明顯增多;再灌注時(shí)，腦組織內(nèi)堆積的AA經(jīng)環(huán)氧合酶生成不穩(wěn)定的中間代謝產(chǎn)物PGG2和PGH2，再經(jīng)過合成酶催化分別生成TXA2與PGI2。但再灌注期間腦組織產(chǎn)生的大量氧自由基可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制PGI2合成酶，使得PGI2減少而TXA2合成相對(duì)過多，導(dǎo)致TXA2/PGI2比例失衡，腦組織微循環(huán)障礙進(jìn)一步加重，出現(xiàn)繼發(fā)性缺血、缺氧，加重腦繼發(fā)性損害〔8〕。

HSP是一類在進(jìn)化上高度保守、在機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護(hù)性蛋白，其中HSP70是HSP家族中最主要的一類〔9〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，HSP70對(duì)腦缺血受損的神經(jīng)元有神經(jīng)保護(hù)作用，可能與其作為伴侶蛋白促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊、抑制細(xì)胞凋亡等作用有關(guān)〔10〕。黃芪注射液等許多藥物能誘導(dǎo)HSP70表達(dá)升高或降低，通過不同的途徑起到神經(jīng)保護(hù)作用〔11〕。

AIS所致的微循環(huán)障礙以及由此所致的神經(jīng)元的損傷，都會(huì)導(dǎo)致 ET、5-HT、D-D、TXA2、PGI2、HSP70 mRNA 的高表達(dá)以及比例失衡。故而針對(duì)上述指標(biāo)的研究，可以反映藥物對(duì)AIS缺血損傷時(shí)腦微循環(huán)障礙及神經(jīng)功能缺損的改善作用。

AIS屬祖國醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇。清代醫(yī)家王清任認(rèn)為，“元?dú)饧忍摫夭荒苓_(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀”，因而提出中風(fēng)的氣虛血瘀論。臨床研究表明，氣虛血瘀證為中風(fēng)的主要中醫(yī)證候，故益氣活血法是AIS的重要治療方法。黃芪注射液及燈盞細(xì)辛注射液為益氣活血法的臨床常用藥物;黃芪注射液為黃芪提取物制成的針劑，具有補(bǔ)氣升陽、利水消腫作用〔12〕;燈盞細(xì)辛注射液為燈盞細(xì)辛經(jīng)提取酚酸類成分制成的滅菌水溶液〔13〕，功以散寒解表、祛風(fēng)除濕、活血化淤、通絡(luò)止痛。臨床研究報(bào)道，兩者合用可明顯降低血漿纖維蛋白原水平，改善血液循環(huán)狀態(tài)，從而減輕神經(jīng)功能缺損，改善患者臨床癥狀，且安全性高。

本研究結(jié)果提示，AIS發(fā)病后4 d內(nèi)其整體神經(jīng)功能有明顯的自行緩解作用;發(fā)病后24～96 h，益氣活血法對(duì)AIS整體神經(jīng)功能的改善優(yōu)于其自行緩解過程，且發(fā)病后4 d內(nèi)益氣活血法對(duì)AIS整體神經(jīng)功能的改善逐漸明顯。

本研究提示，以黃芪注射液及燈盞細(xì)辛注射液為代表的益氣活血法，能夠改善AIS的整體神經(jīng)功能評(píng)分;ET、5-HT、D-D、TXA2、PGI2、HSP70 mRNA高表達(dá)是AIS微循環(huán)障礙的重要機(jī)制與指標(biāo)，益氣活血法能夠通過調(diào)整各微循環(huán)障礙指標(biāo)的表達(dá)，尤其下調(diào)D-D的高表達(dá)，改善AIS微循環(huán)，從而促進(jìn)整體神經(jīng)功能的恢復(fù)。今后研究有待于深化AIS微循環(huán)改善的具體機(jī)制，進(jìn)一步推廣益氣活血法治療AIS的臨床應(yīng)用。

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