王 林 余亮科 王 原 曹克勇 李 靚

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000)

目前認為重癥急性胰腺炎(SAP)胰腺微循環(huán)障礙會導(dǎo)致胰腺腺泡的急性損害和胰腺的急性炎癥〔1〕。臨床上，除有局部病變所特有的表現(xiàn)外，常伴有明顯的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，甚至導(dǎo)致多器官功能衰竭(MOF)，病死率達30% ～50%。如何阻止SAP病情迅速發(fā)展，是臨床與基礎(chǔ)研究一直探索而尚未有效解決的一個難題。本實驗觀察大黃素抑制胰蛋白酶、降低血漿致炎因子水平等作用，從而闡明大黃素對腸黏膜機械屏障的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠90只，體重300～350 g，由河北聯(lián)合大學(xué)實驗動物部提供;?；悄懰徕c購自Sigma公司，用生理鹽水配制成5%的溶液;微泵注射器(德國BM公司);白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-8 、IL-10 同位素檢測試劑盒，購自中國人民解放軍總醫(yī)院放射免疫研究所，批號200910;臺式高速離心機5415C型(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠SAP模型的建立 參照文獻〔2，3〕介紹的方法。動物麻醉后按無菌操作對大鼠剖腹，于十二指腸內(nèi)側(cè)找到片狀分布的胰腺，并在肝門處用無損傷顯微血管夾夾閉膽胰管，在手術(shù)顯微鏡下用微泵注射器對胰管進行穿刺并注射5%牛磺膽酸鈉0.4 ml/kg，壓力高于胰管壓，約10～15 min胰腺出現(xiàn)肉眼可見的水腫出血，表明SAP模型制作成功，松開血管夾，縫合關(guān)閉腹腔并開始計時。所有大鼠術(shù)后均自由飲水飲食。

1.2.2 實驗分組與處理 將70只SD大鼠隨機分為三組:對照組(假手術(shù)組)10只;SAP未治療組(觀察組)30只;SAP大黃素治療組(治療組)30只;觀察組及治療組再分為3個時刻點(12、24、48 h)亞組，各組10只。制模和麻醉成功后，觀察組和治療組用6-0線結(jié)扎總膽胰管近肝門末端，以0.75 mm靜脈留置針在十二指腸端向膽胰管內(nèi)進針5 mm，6-0線結(jié)扎，拔除針芯。接輸液泵向膽胰管內(nèi)以0.2 ml/min速度恒壓逆行注射5%?；悄懰徕c溶液(1 ml/kg)，8 min后拆除膽胰管兩端的縫線，拔除穿刺針，8-0線縫扎穿刺孔。假手術(shù)組僅開腹翻動十二指腸后縫合腹壁。造模后各組經(jīng)胃造瘺置管至空腸上段，8-0縫線固定于胃壁并將造瘺管另一端置于體外，逐層關(guān)腹并固定。大腿根部皮下注射0.9%氯化鈉溶液20 ml/kg體質(zhì)量以補充術(shù)中失液。在大鼠蘇醒并恢復(fù)活動后，治療組通過造瘺管向空腸內(nèi)注入大黃素溶液(5 mg/ml，5 ml/kg)。模型組和對照組注入等量生理鹽水。三組大鼠門靜脈取血備測血清淀粉酶活性、血漿致炎因子含量。

1.2.3 檢測項目與方法

1.2.3.1 血清淀粉酶 采用AR-CHITECTC8000型全自動生化分析儀檢測，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作(上海申索佑福醫(yī)學(xué)診斷用品有限公司)，用酶法測定血清淀粉酶活性。

1.2.3.2 血清致炎因子IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-10 均采用雙抗體夾心ELISA法檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組內(nèi)兩兩比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組各時間點血淀粉酶水平比較 見表1。

表1 各組各時間點血漿淀粉酶水平(U/L，x ± s，n=10)

2.2 大黃素對SAP大鼠IL-1β、TNF-α、IL-8和IL-10含量的影響 觀察組IL-1β、TNF-α、IL-8較對照組高，且隨時間而加重，說明胰腺被膜下注射5%牛磺膽酸鈉造成大鼠SAP時可以影響血漿內(nèi)細胞因子水平;在各時間點，治療組 IL-1β、TNF-α、IL-8較觀察組明顯下降(P ＜0.05);在12、24、48 h，治療組IL-10較SAP模型組明顯下降(P＜0.05)，說明大黃素通過調(diào)節(jié)血漿內(nèi)細胞因子水平達到治療SAP的作用。見表2～表5。

表2 各組大鼠不同時段血漿IL-1β水平比較(x ± s，n=10)

表3 各組大鼠不同時段血漿TNF-α水平比較(x ± s，n=10)

表4 各組大鼠不同時段血漿IL-8水平比較(x ± s，n=10)

表5 各組大鼠不同時段血漿IL-10水平比較(x ± s，n=10)

3 討論

目前研究認為SAP高致死率的主要原因為腸黏膜屏障高通透性使腸道細菌和內(nèi)毒素易位，導(dǎo)致SAP繼發(fā)胰周及全身感染〔4〕。研究表明炎癥介質(zhì)在SAP發(fā)生、發(fā)展過程中起主要作用〔5〕。胰腺炎時胰腺局部微血管痙攣，全身缺血和血壓下降導(dǎo)致灌注不足，胰腺局部微血管痙攣導(dǎo)致微循環(huán)障礙，出現(xiàn)胰腺缺血和再灌注損傷，白細胞粘附和嵌頓于血管壁，此過程又導(dǎo)致白細胞過度激活，大量炎癥介質(zhì)被釋放入血，形成促炎因子激活的級聯(lián)放大的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)互相影響互相促進，進一步導(dǎo)致和加重微循環(huán)障礙，加重胰腺損傷，并引發(fā)SIRS和MODS，因此，炎癥介質(zhì)在SAP中起著主要作用。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，大鼠SAP時，腸組織微循環(huán)血流量明顯減少，血清IL-1β活性較對照組明顯升高。TNF-α是SAP時升高最早的炎癥介質(zhì)，能直接損傷腸上皮細胞間的緊密連接，還可加速谷氨酰胺消耗，阻止其向α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化，降低腸黏膜細胞三磷酸腺苷水平，加重腸黏膜機械屏障損傷，造成細菌移位;又可誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、IL-8以及自身基因表達，從而產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的級聯(lián)放大作用，導(dǎo)致血管通透性增加、微循環(huán)障礙、細胞功能受損、毛細血管微血栓形成、氧自由基的產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)加劇等不良作用出現(xiàn)。同樣，IL-8可刺激炎癥，激化炎癥細胞對炎癥介質(zhì)的作用，并能協(xié)同TNF-α作用于微血管系統(tǒng)，加重微血栓形成和組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能有效抑制干擾素-γ+內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌細胞株HT-29分泌IL-8及核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的活化，具有抗炎作用〔6〕。本實驗證實，SAP時大量活性物質(zhì)和炎癥介質(zhì)被釋放入血，導(dǎo)致一系列血液炎性因子的變化，且變化的程度與胰腺損傷的嚴(yán)重程度以及與疾病的預(yù)后均有密切關(guān)系。既往研究認為，大黃可增加胃腸黏膜灌注量，降低腸黏膜及腸毛細血管通透性，清除氧自由基，促進胃腸黏膜新陳代謝，促進腸黏膜內(nèi)杯狀細胞增生，抑制腸道內(nèi)細菌過度繁殖和腸道LPS吸收，改善線粒體的呼吸功能，活血化瘀、改善微循環(huán)〔7〕。實驗和臨床研究均證實，傳統(tǒng)中藥大黃對腸屏障損傷的保護作用明確，其作用機制是多方面的。本研究發(fā)現(xiàn)大黃的主要成分大黃素明顯降低了治療組大鼠TNF-α和IL-8水平，有效地減輕了胰腺的損害，降低了大鼠的病死率，延長了生存時間，用藥期間沒有發(fā)現(xiàn)大鼠更多不良反應(yīng)的出現(xiàn)，這也說明該藥物具有安全性，也為臨床使用奠定了一定理論基礎(chǔ)。

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