覃紅斌 魏 蕾 張京偉 唐軍民

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)tau蛋白過(guò)度磷酸化，并由此形成異常的神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)是AD的一個(gè)特征性病理變化〔1〕。神經(jīng)元內(nèi)正常的tau蛋白何以被磷酸化，并形成NFTs的確切病因和機(jī)制尚不清。Niemann Pick type C(NPC)病人腦同時(shí)存在膽固醇代謝失衡和NFTs，提示膽固醇與tau蛋白過(guò)度磷酸化可能存在某種聯(lián)系〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)膽固醇在神經(jīng)纏結(jié)變的神經(jīng)元中聚集〔3〕，支持細(xì)胞內(nèi)膽固醇過(guò)載與tau蛋白磷酸化有關(guān)。本研究基于上述背景，通過(guò)觀察大鼠海馬膽固醇含量升高后tau蛋白磷酸化程度的變化，探討其在AD中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠(同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，清潔級(jí))，體重200～250 g，2～3月齡，常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組9只。

1.2 行為學(xué)檢測(cè) 選取40只大鼠進(jìn)行1 w的Morris水迷宮訓(xùn)練，遴選出36只成績(jī)相近的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，訓(xùn)練每天1次，每次3個(gè)象限。腦立體定位注射72 h后再次進(jìn)行1次水迷宮檢測(cè)，檢測(cè)1個(gè)象限。

1.3 腦立體定位注射 SD大鼠稱重，以5%水合氯醛0.6 ml/100 g腹腔注射麻醉，固定大鼠于腦立體定位儀上，使前后囟保持水平，頭頂局部剃毛，消毒。頭頂正中矢狀切口長(zhǎng)約1.5 cm，用骨膜分離器完全分離骨膜，使前后囟暴露。以前囟為零點(diǎn)定標(biāo):前囟后3.8～4.5 mm，中線旁開(kāi)2.0 mm，用臺(tái)式牙科鉆在雙側(cè)海馬各鉆1孔，用10μl微量注射推進(jìn)器緩慢注射。對(duì)照組注射0.9%Nacl，低劑量組注射2μg/ml膽固醇，中劑量組注射8μg/ml膽固醇，高劑量組注射20μg/ml膽固醇，總劑量均為10μl/只。進(jìn)針至硬膜下約3.0 mm，緩慢注入，注射完畢后留針10 min，再緩慢退針，以防藥物沿針道返回?？p合皮膚，局部涂布青霉素粉末，將動(dòng)物置入籠內(nèi)側(cè)臥，待其蘇醒。

1.4 組織總膽固醇含量的測(cè)定 麻醉動(dòng)物并斷頭處死，迅速取出腦組織置于0～4℃生理鹽水沖洗表面血跡，置冰盤(pán)中快速分離雙側(cè)海馬，用分析天平準(zhǔn)確稱取海馬組織，以800.0μl/50.0 mg的比例加入含2%SDS的磷酸緩沖液，冰浴勻漿，混勻30 s。取50μl移入離心管，然后加入100μl含2%SDS的磷酸緩沖液混勻。接著加入250μl氯仿∶甲醇(體積比2∶1)，混勻30 min，離心后吸取下層氯仿相，余下的溶液再次加入250μl氯仿/甲醇重復(fù)提取1次吸取下層氯仿相，兩次氯仿相溶液合并，干燥。干燥后的沉淀加入30μl異丙醇∶聚乙二醇辛基醚(體積比2∶1)，旋渦震蕩混勻2 min，再加入雙蒸水45μl，旋渦震蕩混勻2 min，該溶液即為待測(cè)液。待測(cè)液膽固醇的含量用膽固醇氧化酶-比色法(CHOD-PAP法)按照總膽固醇測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定，總膽固醇測(cè)定試劑盒為上海榮盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.5 免疫組織化學(xué) 用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行心臟灌注固定腦組織待取出腦組織后再在上述固定液中固定6～12 h，即可直接切片。免疫組織化學(xué)染色主要步驟參照說(shuō)明書(shū)。DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.6 免疫印跡 麻醉動(dòng)物并斷頭處死，迅速取出腦組織置于0～4℃生理鹽水沖洗表面血跡，置冰盤(pán)中快速分離雙側(cè)海馬，以1∶9的比例加入蛋白勻漿提取液，冰水中用1 ml勻漿器制成10%的蛋白勻漿，離心10 min，取上清備用。用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白含量，保證每泳道加入相同量蛋白。電泳結(jié)束后將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入一抗tau-1(識(shí)別Ser-198/Ser-199/Ser-202非磷酸化位點(diǎn)，多克隆抗體，1∶1 000)、PHF-1(識(shí)別 Ser-396/Ser-404 磷酸化位點(diǎn)，單克隆抗體，1∶1 000)和R134d抗體(識(shí)別tau磷酸化和非磷酸化位點(diǎn)，多克隆抗體，1∶1 000)，以上抗體均購(gòu)自 SAB公司，4℃過(guò)夜，加入熒光標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h，odyssey成像系統(tǒng)顯色。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 給藥72 h后行為學(xué)測(cè)試 如表1所示給藥72 h后水迷宮，對(duì)各組給藥后潛伏期，穿越平臺(tái)次數(shù)作單向方差分析，低劑量組有變化(P＜0.05)，中劑量，高劑量組較對(duì)照組變化明顯(P ＜0.01)。

表1 各組給藥后潛伏期變化(x ± s，n=9)

2.2 海馬膽固醇含量 與對(duì)照組比較〔(0.60±0.40)mg/g〕，低劑量組略增高 〔(0.64 ±0.01)mg/g，P ＜0.05〕，中、高劑量組明顯增高 〔(1.18 ±0.03)、(1.31±0.03)mg/g，P ＜0.01〕。

2.3 免疫組化結(jié)果 因背景色不一，以R134d標(biāo)準(zhǔn)化PHF-1與tau-1后，大鼠海馬免疫組化染色結(jié)果顯示:tau蛋白主要分布在大鼠海馬CA3區(qū)，PHF-1染色顯示隨腦膽固醇含量增高，tau S396/S404位點(diǎn)磷酸化水平也隨之增高，低劑量組有變化(P＜0.05)，中劑量組，高劑量組升高明顯(P＜0.01)。tau-1染色顯示隨腦膽固醇含量增高，tau S198/S199/S202位點(diǎn)非磷酸化水平也隨之降低，且中劑量組，高劑量組降低明顯(P＜0.01)。R134d示總tau無(wú)明顯變化(圖1，表2)。

2.4 免疫印跡結(jié)果 雙側(cè)海馬給藥72 h后，大鼠海馬免疫印跡結(jié)果顯示:β-actin示上樣無(wú)組內(nèi)差異，以R134d標(biāo)準(zhǔn)化PHF-1與tau-1后，PHF-1染色顯示隨腦膽固醇含量增高，tau S396/S404位點(diǎn)磷酸化水平也隨之增高，低劑量組有變化(P＜0.05)，且中劑量組，高劑量組升高明顯(P＜0.01)。tau-1染色顯示隨腦膽固醇含量增高，tau S198/S199/S202位點(diǎn)非磷酸化水平也隨之降低，且中劑量組，高劑量組降低明顯(P＜0.01)。R134d示總tau無(wú)明顯變化(圖2，表3)。

圖1 三種tau蛋白抗體的免疫組化(DAB，×200)

圖2 三種tau蛋白抗體的免疫印跡

表2 三種tau蛋白抗體的免疫組化(n=9)

表3 三種tau蛋白抗體的免疫印跡(n=9)

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨膽固醇含量逐漸升高，tau去磷酸化程度逐漸降低，相反磷酸化程度逐漸升高，且動(dòng)物的空間記憶能力也隨腦膽固醇含量的升高而下降。高膽固醇水平能夠促進(jìn)腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)β分泌酶降解為β淀粉樣蛋白(Aβ)〔4〕，在某些特殊的部位，膽固醇的更新非?；钴S，如海馬神經(jīng)元突觸后膜上的膽固醇，24 h內(nèi)有20%以上被更新〔5〕，膽固醇在腦的代謝對(duì)腦細(xì)胞的生長(zhǎng)、神經(jīng)修復(fù)和重塑有重要作用。由此可見(jiàn)，膽固醇的含量對(duì)于學(xué)習(xí)和記憶的影響效果顯著。雖然已知膽固醇在72 h內(nèi)可以導(dǎo)致tau過(guò)度磷酸化，但也有另一項(xiàng)神經(jīng)元培養(yǎng)研究顯示，膽固醇水平的減少促進(jìn)tau蛋白磷酸化〔7〕，對(duì)這種矛盾現(xiàn)象的解釋是，tau蛋白磷酸化與細(xì)胞膽固醇量無(wú)關(guān)，而與細(xì)胞的特殊區(qū)域(如CRDs)有關(guān)，可能是該特殊區(qū)域傳導(dǎo)著導(dǎo)致tau蛋白磷酸化的信號(hào)，這可能與膽固醇富載后神經(jīng)元內(nèi)相應(yīng)的蛋白激酶和、或酯酶的變化有一定的關(guān)系，也有研究顯示，膽固醇過(guò)少會(huì)抑制樹(shù)突的延伸和突觸的生成，并認(rèn)為這可能與tau蛋白磷酸化有關(guān)〔7〕。研究已發(fā)現(xiàn)在諸多降低膽固醇藥物中，他汀類(32羥基-32甲基-戊二酰輔酶A還原酶抑制劑)在對(duì)抗AD特異病理變化方面是最有效的〔8〕，但其具體機(jī)制還不清楚。膽固醇與AD關(guān)系的深入研究，可能會(huì)給AD治療帶來(lái)新的曙光，但還需要深入研究膽固醇在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的代謝機(jī)制。

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