毛 東 付曉光 陸 航

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸外科，遼寧 錦州 121001)

胃癌的預(yù)后與癌組織浸潤(rùn)深度及是否發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 相關(guān)〔1〕。研究顯示，腫瘤相關(guān)淋巴管的形成能夠促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散〔2〕。因此當(dāng)前有很多研究關(guān)注于如何抑制腫瘤環(huán)境下淋巴管的形成。VEGFR3是最先被驗(yàn)證的淋巴管生成的特異性標(biāo)記物。VEGFR3是淋巴管內(nèi)皮生長(zhǎng)刺激因子VEGFC的特異性受體。VEGFC與VEGFR3結(jié)合后可引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮促進(jìn)淋巴管新生的作用。神經(jīng)纖毛蛋白(NRPs)是一種跨膜糖蛋白，目前研究證明NRPs在腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用〔3〕。最新研究表明NRP2參與了VEGFC誘導(dǎo)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和淋巴管新生(特別是與腫瘤相關(guān)的淋巴管功能性新生)功能，在腫瘤動(dòng)物模型中阻斷NRP2功能發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移至哨兵淋巴結(jié)和遠(yuǎn)隔器官減少的現(xiàn)象〔4〕。本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建重組腺病毒載體介導(dǎo)的NRP2-shRNA基因沉默載體，轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC7901后檢測(cè)該細(xì)胞中NRP2的表達(dá)情況以及NRP2-shRNA轉(zhuǎn)染前后對(duì)于抑制SGC7901細(xì)胞的增殖、侵襲遷移的能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 胃癌細(xì)胞株SGC7901購(gòu)自中國(guó)協(xié)和細(xì)胞庫(kù);RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司;Trizol試劑、RT-PCR試劑盒、Marker、限制性內(nèi)切酶等均購(gòu)自TaKaRa公司;Lipofectamine 2000、OPTI-MEM等購(gòu)自Invitrogen公司;兔抗人NRP2單克隆抗體、二抗、β-actin內(nèi)參照購(gòu)自Santa Cruz公司;超純質(zhì)粒提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司;RNAi干擾序列以及引物序列設(shè)計(jì)、合成由賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司完成，并統(tǒng)一構(gòu)建到重組腺病毒系統(tǒng)pAdEasy-1上，同時(shí)攜帶GFP作為熒光示蹤標(biāo)記物，-80℃保存;干擾序列及分組見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC7901 胃癌細(xì)胞株SCG7901接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，常規(guī)培養(yǎng)24 h，分別轉(zhuǎn)染上述4種腺病毒液，37℃培養(yǎng)1 h后，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察，以不引起明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的最大MOI作為最佳MOI值，并以最佳MOI值再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 RT-PCR測(cè)定轉(zhuǎn)染NRP2-shRNA沉默效率 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，根據(jù)TRizol法提取總RNA，電泳驗(yàn)證。按照按照RTPCR二步法試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，之后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)各條帶OD值，計(jì)算沉默效率，篩選出效率較高的片段。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.2.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況 胃癌細(xì)胞SGC7901處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)制成細(xì)胞懸液，以密度為1×104/孔接種到96孔板，37℃、5%CO2濃度常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入含上述效率最高的NRP2-shRNA腺病毒液的培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)液，于轉(zhuǎn)染后72 h加入5 mg/ml的MTT溶液每孔10 ml，溫箱孵育4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150μl震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)的OD值，以無(wú)細(xì)胞的空白孔調(diào)零，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.2.4 Western印跡測(cè)定SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染后NRP2蛋白表達(dá)效率 取轉(zhuǎn)染腺病毒72 h的SGC7901細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS沖洗3次后加入含1%PMSF的裂解液400μl，置于冰上裂解30 min，4℃離心12 000 r/min×5 min，取上清。采用BCA法計(jì)算蛋白濃度。蛋白與上樣緩沖液以 3∶1比例混合，加入10μl/mlβ-巰基乙醇，煮沸5 min。配置8%分離膠、5%濃縮膠后進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，放置保鮮袋內(nèi)加入1∶500稀釋濃度的一抗4℃過(guò)夜，加入二抗室溫孵育1 h，用TBST洗滌PVDF膜，BCIP/NBT染色工作液進(jìn)行顯色反應(yīng)，凝膠成像系統(tǒng)分析目的條帶及內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用x±s表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒液轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC7901情況 胃癌細(xì)胞株SGC7901正常培養(yǎng)生長(zhǎng)匯合至70%可見(jiàn)細(xì)胞成梭形貼壁生長(zhǎng)，分布均勻，胞漿飽滿;經(jīng)腺病毒介導(dǎo)的NRP2-shRNA沉默片段轉(zhuǎn)染SGC7901 72 h后發(fā)現(xiàn)有大量綠色熒光表達(dá)而未見(jiàn)明顯CPE現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。

圖1 SCG7901細(xì)胞生長(zhǎng)情況

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 轉(zhuǎn)染腺病毒液72 h后RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示各組內(nèi)參β-actin條帶亮度相似，各重組腺病毒轉(zhuǎn)染組NRP2 mRNA水平低于陰性轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組(圖2)，3種病毒液與陰性對(duì)照和空白對(duì)照組相比均存在顯著性差異(P＜0.05)，表明3種病毒液均不同程度下調(diào)NRP2基因mRNA的表達(dá)，其中以載體NRP2-shRNA-3(C組)抑制效應(yīng)最強(qiáng)，與A組和B組相比，有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組NRP2 mRNA相對(duì)OD值表達(dá)情況(x ± s，n=3)

2.3 MTT檢測(cè)SGC7901細(xì)胞增殖情況 陰性對(duì)照組與空白組細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，兩組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)組(C組)經(jīng)腺病毒載體轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖程度顯著減少，與前兩組相比有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 MTT法檢測(cè)三組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的OD值

圖2 RT-PCR檢測(cè)各組NRP2 mRNA表達(dá)情況

2.4 Western印跡測(cè)定NRP2蛋白表達(dá)量 陰性對(duì)照組(D組)與空白組(E組)NRP2蛋白相對(duì)OD值分別為0.77±0.15和0.82±0.10，明顯高于實(shí)驗(yàn)組(C組)的0.14±0.01，有顯著性差異(P＜0.01)，而D組與E組之間無(wú)顯著性差異(圖3，P ＞0.05)。

圖3 Western印跡檢測(cè)各組NRP2蛋白表達(dá)情況

3 討論

NRPs是一種跨膜糖蛋白，最初是作為軸突導(dǎo)向分子Semaphorin的受體而發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)細(xì)胞的導(dǎo)向中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步研究證明NRP2在血管的生成、發(fā)育及腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移中也起著關(guān)鍵的作用〔5，6〕，給我們胃癌的基因治療方面提供了新的思路。

在本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中我們選取SGC7901細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。采用RNAi干擾技術(shù)抑制胃癌細(xì)胞SGC7901 NRP2基因的表達(dá)。由于siRNA在體內(nèi)的半衰期短，對(duì)基因的抑制作用較短暫，為了能夠較長(zhǎng)時(shí)間抑制NRP2基因，我們采用構(gòu)建shRNA腺病毒表達(dá)載體來(lái)沉默NRP2基因，重組載體轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后通過(guò)RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)DNA序列，從而在體內(nèi)合成shRNA，合成的shRNA在Dicer酶的作用下環(huán)狀區(qū)域斷裂形成雙鏈siRNA，進(jìn)而產(chǎn)生干擾效應(yīng)。由于shRNA腺病毒表達(dá)載體可在體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生siRNA，因此，可達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間沉默NRP2基因的作用。另外，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)阻斷SGC7901細(xì)胞中NRP2基因的作用抑制了癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)和淋巴轉(zhuǎn)移。在實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)RT-PCR、MTT、Western印跡方法分別檢測(cè)了SGC7901細(xì)胞中NRP2基因的mRNA和蛋白的表達(dá)情況以及癌細(xì)胞增殖情況，結(jié)果表明攜帶有GFP的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901成功，且轉(zhuǎn)染效率較高，重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901導(dǎo)致NRP2基因的mRNA和蛋白表達(dá)降低，說(shuō)明腺病毒載體可以抑制胃癌細(xì)胞SGC7901中的NRP2基因的mRNA表達(dá)及轉(zhuǎn)錄后的蛋白表達(dá)，NRP2-shRNA腺病毒載體具有抑制SGC7901細(xì)胞增殖的作用。

綜上所述，我們成功的利用重組腺病毒載體抑制了NRP2基因在胃癌細(xì)胞SGC7901中的表達(dá)，為下一步動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)和前期準(zhǔn)備。

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