韓建科 魏 聰 賈振華 常麗萍 王宏濤 張彥芬

(河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035)

長(zhǎng)期的過度疲勞得不到有效緩解會(huì)對(duì)人體多個(gè)系統(tǒng)造成損害，尤其對(duì)血管系統(tǒng)的危害更大，可引起血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化及冠脈狹窄，引發(fā)嚴(yán)重的心血管事件。研究表明，脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lp-PLA2)水解氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)磷脂成分生成的溶血性磷脂酰膽堿(LPC)是導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙的重要因子〔1〕。LPC發(fā)揮損傷內(nèi)皮細(xì)胞的作用也需要特異性受體作用，其中包括最新發(fā)現(xiàn)的4型G蛋白耦聯(lián)受體(GPR4)。最近研究表明，LPC通過內(nèi)源性GPR4介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙性異常。既往研究發(fā)現(xiàn)過度疲勞可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，而對(duì)過度疲勞模型大鼠Lp-PLA2激活損傷血管內(nèi)皮機(jī)制未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將研究過度疲勞致血管內(nèi)皮功能障礙大鼠血清lp-PLA2和GPR4的表達(dá)變化及通絡(luò)干預(yù)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性 Wistar大鼠60只，體重220～250 g，由北京維通利華動(dòng)物中心提供〔許可證號(hào):SCXK(京):2006-2009〕。大鼠籠養(yǎng)，5只/籠，飼養(yǎng)于國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室(心腦血管絡(luò)病)實(shí)驗(yàn)中心，光照12 h/d，溫度20℃ ～23℃，相對(duì)濕度40% ～60%。

1.2 藥物 人參總皂苷(批號(hào):20090116)和通心絡(luò)超微粉(批號(hào):20090228):石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供。人參用量:生藥1.2 g·kg-1·d-1(1 mg干粉約為0.117 g生藥)，通心絡(luò)用量:1 g干粉約為1.46 g生粉(生藥1.2 g·kg-1·d-1)。

1.3 試劑 內(nèi)皮素(ET)放射免疫試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，批號(hào):20091025);一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20091106);lp-PLA2試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司，批號(hào):E02L0205);GPR4多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司，批號(hào):ab75330)。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、蛋白定量試劑盒(美國(guó)Pierce公司)。RNA提取試劑Trizol Reagent(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)，核糖核酸酶抑制劑(RNasin)，dNTP，Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)，隨機(jī)引物(Random primers)，瓊脂糖(agarose)均為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品;β-actin(Santa Cruz公司)。

1.4 儀器設(shè)備 大鼠泳缸〔國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室(心腦血管絡(luò)病)實(shí)驗(yàn)中心制作〕;S-3500型掃描電鏡(日本日立公司);ABI 7300 Real-Time PCR System(美國(guó) ABI公司);UVP凝膠掃描系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司);電轉(zhuǎn)膜儀、半干轉(zhuǎn)膜儀、垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.5 方法

1.5.1 分組及給藥 將大鼠隨機(jī)分為:①對(duì)照組。②疲勞應(yīng)激組:參照文獻(xiàn)〔2〕并進(jìn)行改良，以“基礎(chǔ)飲食+負(fù)重力竭游泳法”建立過度疲勞動(dòng)物模型，造模大鼠于基礎(chǔ)飲食(每只成年大鼠于靜息狀態(tài)下的進(jìn)食量，約相當(dāng)于自身體重的5%)狀態(tài)下在25℃ ～27℃水溫的自制泳缸(60 cm×40 cm×100 cm)中，每日強(qiáng)迫負(fù)重(尾部懸掛自身體重5%的重物)游泳兩次，前后相差10 min，每次游泳至力竭為止，如見大鼠游泳范圍逐漸縮小，動(dòng)作明顯失調(diào)，頭部沒入水面下10 s不能上浮則終止游泳。連續(xù)力竭游泳14 d至模型建立。③人參組(生藥1.2 g·kg-1·d-1);④通心絡(luò)組(生藥1.2 g·kg-1·d-1)。

1.5.2 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

1.5.2.1 過度疲勞模型評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)?zāi)y(cè)體重。爬桿時(shí)間:于末次給藥后，將單只大鼠放在懸桿架的玻璃棒上，使其肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，記錄大鼠由于肌肉疲勞從玻璃棒跌落的時(shí)間，第三次跌落時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，累計(jì)計(jì)量三次跌落時(shí)間為爬桿時(shí)間。最后一次力竭游泳時(shí)間。

1.5.2.2 血液指標(biāo) 10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔麻醉大鼠后，腹主動(dòng)脈采血，一份注入含有10%乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉 30μl和抑肽酶 40μl的試管中，混勻，4℃，3 000 r/min，離心10 min;另留二份常規(guī)分離血清后，-20℃保存。采用放射免疫分析法檢測(cè)ET，硝酸還原酶法檢測(cè)NO，酶聯(lián)免疫吸附方法檢測(cè)lp-PLA2，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5.2.3 掃描電鏡觀察 造模結(jié)束后10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仔細(xì)分離并截取約1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm大小主動(dòng)脈標(biāo)本迅速投入2.5%戊二醛中4℃固定，PBS充分清洗后，用1%鋨酸4℃固定再用PBS充分清洗，酒精梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥器對(duì)樣品進(jìn)行干燥，真空鍍膜儀對(duì)樣品進(jìn)行金屬鍍膜，掃描電鏡觀察并攝片。

1.5.3 Real Time PCR法檢測(cè)GPR4 mRNA表達(dá) 取約100 mg血管組織，Trizol一步法提取組織總RNA，42℃反轉(zhuǎn)錄50 min合成第一鏈cDNA，采用染料法(Syber Green I)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。擴(kuò)增完畢后，進(jìn)入SDSv1.3軟件結(jié)果分析界面，以GAPDH為內(nèi)參照基因，與對(duì)照組相比，得到各組目的基因表達(dá)的定量值(RQ值)，將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。GPR4(115 bp)所用引物序列:上游5'-CGGGTCAAGACAGCAGTAG-3'，下游5'-AGAAGGTGTGGTTGTAGCGAT-3'。

1.5.4 Western印跡法檢測(cè)GPR4蛋白表達(dá) 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取主動(dòng)脈組織，用PBS洗去組織表面殘留血液，取100 mg主動(dòng)脈組織標(biāo)本，加入組織裂解液下勻漿，4℃離心分離上清，采用改良酚試劑法進(jìn)行蛋白定量。取各組蛋白樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜后封閉，經(jīng)一抗結(jié)合后洗膜，二抗結(jié)合，洗膜后采用增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。凝膠成像系統(tǒng)照相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用quantity one軟件分析，掃描光密度(OD)值，蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用x±s表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，多個(gè)樣本均數(shù)比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較用最小顯著差法(LSD)，若方差不齊則采用Satterthwaite-t檢驗(yàn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、爬桿時(shí)間、游泳時(shí)間變化 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)?zāi)┢趹?yīng)激組大鼠體重和爬桿時(shí)間均顯著下降(均P＜0.01);與模型組比較，人參和通心絡(luò)干預(yù)對(duì)體重?zé)o明顯影響，但均可以明顯延長(zhǎng)大鼠爬桿時(shí)間(P＜0.05，P＜0.01);比較各組最后一次力竭游泳時(shí)間，人參和通心絡(luò)均有延長(zhǎng)大鼠力竭游泳時(shí)間的作用(P＜0.05)。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)?zāi)└鹘M大鼠體重、爬桿時(shí)間、最后一次力竭游泳時(shí)間變化(x ± s，n=15)

2.2 掃描電鏡下動(dòng)脈內(nèi)皮形態(tài)變化 對(duì)照組血管內(nèi)皮表面光滑，內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密，排列規(guī)整;疲勞應(yīng)激組內(nèi)皮細(xì)胞界限消失，細(xì)胞脫落，表面有紅細(xì)胞等沉積物;人參組和通心絡(luò)組內(nèi)皮細(xì)胞表面光滑，界限清晰，連接較緊密，無剝脫損傷。見圖1。

2.3 各組大鼠血液NO、ET、lp-PLA2水平 與對(duì)照組比較，疲勞應(yīng)激組大鼠血清NO水平明顯降低(P＜0.05)，血漿ET水平顯著升高(P＜0.01)，血清lp-PLA2水平顯著升高(P＜0.01);與疲勞應(yīng)激組比較，人參組、通心絡(luò)組大鼠血清NO水平均顯著升高(均P＜0.05)，血漿ET水平顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);血清lp-PLA2水平顯著降低(均P＜0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血液ET、NO、lp-PLA2水平(x ± s，n=15)

2.4 RT-PCR檢測(cè)GPR4 mRNA表達(dá) 疲勞應(yīng)激組大鼠血管組織GPR4 mRNA表達(dá)(4.34±0.52)較正常組(0.81±0.18)顯著上調(diào)(P＜0.01)。而人參和通心絡(luò)均能夠明顯下調(diào)GPR4 mRNA的表達(dá)(2.32±0.32，1.49±0.30)，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)。

2.5 Western印跡檢測(cè)GPR4蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，疲勞應(yīng)激組GPR4蛋白表達(dá)顯著上調(diào);與過勞組比較，人參和通心絡(luò)干預(yù)組GPR4蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，且通心絡(luò)下調(diào)更加明顯。見圖2。

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞掃描電鏡(×1 500)

圖2 各組主動(dòng)脈GPR4蛋白表達(dá)變化

3 討論

由于近些年來“過勞死”現(xiàn)象日趨增多，而且有向年輕化發(fā)展的趨勢(shì)，對(duì)于過勞等社會(huì)心理因素在心腦血管疾病發(fā)生中的作用應(yīng)引起重視。既往研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)重力竭游泳可導(dǎo)致血管內(nèi)皮形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化及功能障礙，如內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、炎細(xì)胞浸、內(nèi)皮分泌NO減少、ET增加〔3〕。長(zhǎng)期過度疲勞導(dǎo)致的慢性應(yīng)激促使體內(nèi)自由基產(chǎn)生增多，氧化應(yīng)激是內(nèi)皮損傷過程中的重要因素。病理情況下，超氧陰離子等自由基促使過多的LDL氧化生成ox-LDL。ox-LDL與內(nèi)皮功能障礙關(guān)系密切，是血管損傷過程中的重要起始因子〔4〕。

研究證明，lp-PLA2水解ox-LDL上的氧化卵磷脂產(chǎn)生LPC和氧化的非酯化游離脂肪酸等促炎物質(zhì)起到促動(dòng)脈硬化作用〔5〕，LPC在lp-PLA2影響內(nèi)皮功能障礙中發(fā)揮重要作用，lp-PLA2在早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變中的作用主要通過LPC產(chǎn)生〔1〕。LPC可以通過與細(xì)胞膜上的特定受體相互作用發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，如孤兒G蛋白耦聯(lián)受體(G2A)、GPR4等，其中GPR4受體分布廣泛，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中有一定表達(dá)〔6〕。最近研究表明，LPC通過內(nèi)源性GPR4受體介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞障礙性功能異常，通過RNA干擾GPR4受體，可以部分抑制LPC誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維形成、RhoA激酶激活以及內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，GPR4受體可能在LPC觸發(fā)的炎癥反應(yīng)中具有重要作用〔7〕。

研究證明通心絡(luò)可以消除自由基損傷，起到抗氧化、改善內(nèi)皮功能的作用。人參作為通心絡(luò)拆方研究的代表藥，針對(duì)絡(luò)氣虛滯具有益氣通絡(luò)的作用。研究顯示，人參對(duì)高同型半胱氨酸血癥所致的內(nèi)皮損傷有防治作用，可以改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能。人參還具有抗中樞疲勞，抗自由基，調(diào)節(jié)糖代謝等抗疲勞作用〔8〕。本研究對(duì)過度疲勞引起的血管內(nèi)皮損傷大鼠血清lp-PLA2和主動(dòng)脈GPR4受體表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)過度疲勞模型大鼠血清lp-PLA2水平增加，主動(dòng)脈GPR4 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加。通絡(luò)干預(yù)對(duì)血清lp-PLA2水平和主動(dòng)脈GPR4表達(dá)均有顯著抑制作用。這可能是通絡(luò)方藥阻止和減緩血管內(nèi)皮損傷的重要機(jī)制之一。因此，對(duì)于心腦血管疾病的防治，除倡導(dǎo)科學(xué)的工作與生活態(tài)度、健康的生活方式外，對(duì)于已經(jīng)因過勞等不良社會(huì)心理因素誘發(fā)血管內(nèi)皮功能損傷者，通絡(luò)治療是防治此類疾病發(fā)生發(fā)展的重要手段之一。

1 Kougias P，Chai H，Lin PH，et al.Lysophosphatidylcholine and secretory phospholipase A2 in vascular disease:mediatorsof endothelial dysfunction and atherosclerosis〔J〕.Med Sci Monit，2006;12:RA5-16.

2 程志清，姚 立，龔文波，等.Wistar大鼠心氣虛證模型的建立與評(píng)價(jià)〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2003;18(11):654-8.

3 梁俊清，吳以嶺，賈振華，等.氣虛對(duì)大鼠血管內(nèi)皮功能的影響及通心絡(luò)超微粉抗氧化保護(hù)作用的研究〔J〕.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2007;13(4):267-71.

4 Nedeljkovic ZS，Gokce N，Loscalzo J.Mechanisms of oxidative stress and vascular dysfunction〔J〕.Post grad Med J，2003;79(930):195-200.

5 Lavi S，McConnell JP，Prasad A，et al.Local production of lipoprotein-associated phospholipaseA2 and lysophosphotidylcholine in the coronary circulation:association with early coronary atherosclerosis and endothelial dysfunction in Humans〔J〕.Circulation，2007;115(21):2715-21.

6 Kim KS，Ren J，Jiang Y，et al.GPR4 plays a critical role in endothelial cell function and mediates the effects of sphingosylphosphorylcholine〔J〕.FASEB J，2005;19(7):819-21.

7 Qiao J，Huang F，Naikawadi RP，et al.Lysophosphatidylcholine impairs endothelial barrier function through the G protein-coupled receptor，GPR4〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2006;291(1):L91-101.

8 王 瑩，蔡?hào)|聯(lián).人參抗疲勞作用研究進(jìn)展〔J〕.氨基酸和生物資源，2005;27(3):68-70.