魏金鳳，李玉玲，莊金山，鄧均華，白朝勇,

(1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心生物制品研究所，河南洛陽471003；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽471003)

禽流感(Avian Influence，AI)是由正粘病毒科、流感病毒屬A型流感病毒引起的、主要以禽類感染為主的疾病綜合征。禽流感分為高致病性禽流感和低致病性禽流感，高致病性禽流感引起家禽高發(fā)病率及死亡率，而低致病性禽流感則導(dǎo)致家禽出現(xiàn)呼吸道癥狀、生長(zhǎng)發(fā)育受阻及產(chǎn)蛋下降等，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展?，F(xiàn)世界各地都有特定的毒株引起的禽流感暴發(fā)和流行，目前我國禽流感的流行以低致病性禽流感H9N2亞型為主型，占禽流感陽性雞群總數(shù)的93.89%。該亞型禽流感常常繼發(fā)或并發(fā)感染新城疫、大腸桿菌等疾病引起大批的雞只死亡，給我國畜牧業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

2010年12月，河南省某蛋雞場(chǎng)出現(xiàn)雞群產(chǎn)蛋率急劇下降，雞群精神不振、食欲下降、并有明顯的咳嗽、喘鳴、呼吸困難等呼吸道癥狀，部分雞只出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，疑為禽流感感染。死亡雞病理剖檢可見肺部有干酪樣栓塞，氣管有環(huán)狀出血，心、肝等臟器有點(diǎn)狀出血，輸卵管充血、水腫，并有卵黃性腹膜炎出現(xiàn)。采集發(fā)病雞內(nèi)臟及喉頭、泄殖腔拭子，接種SPF雞胚，分離到一株病毒，命名為YB株。分離的毒株純化后經(jīng)血清學(xué)鑒定、PCR檢測(cè)和HA基因遺傳進(jìn)化分析，鑒定為H9N2亞型低致病性禽流感病毒?，F(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

一、材料與方法

(一)材料

1.SPF種蛋及SPF雞。購自北京梅里亞維通公司，SPF雞胚由本公司孵化至10日齡，用于種毒的分離、傳代及毒價(jià)測(cè)定。

2.標(biāo) 準(zhǔn) 陽 性 血 清。AI H9、AI H5標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，ND、EDS-76標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

3.試劑及引物。Ex-Taq DNA聚合酶、dNTPs、AMV反轉(zhuǎn)錄酶等均購自TakaRa公司，病毒RNA抽提試劑盒購自QIAGEN公司。

參考相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表的引物序列合成3對(duì)引物，分別用于AIV H9亞型、N2亞型鑒定和AIV H9亞型HA全基因擴(kuò)增，引物序列見表1。

(二)方法

1.病毒的分離及純化。

(1)病毒的分離：無菌采集病死雞心、肝、脾等臟器及喉頭、泄殖腔拭子，臟器放入滅菌平皿中無菌條件下進(jìn)行研碎，按1:5的比例加入含1 000單位/ml雙抗的生理鹽水，于-20℃反復(fù)凍融3次。棉拭子直接放入含1萬單位雙抗的生理鹽水中，2℃～8℃作用4～8 h，臟器及棉拭子均3 500 rpm離心10 min，取上清，混合后接種10日齡的SPF雞胚5枚，0.2 ml/枚。雞胚置37℃孵育，每天早晚各照檢一次，及時(shí)取出死胚置4℃冰箱中保存，棄去24 h內(nèi)的死亡胚，至96 h時(shí)取出全部雞胚。逐胚收集雞胚尿囊液，置-20℃冷凍保存?zhèn)溆?，并觀察胚體病變。

(2)分離毒的純化與傳代：病毒的純化采用雞胚終點(diǎn)稀釋法，即將分離毒用滅菌PBS(pH7.2、0.01M)進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋至10-9，取10-6、10-7、10-8和 10-94個(gè)稀釋度接胚，每個(gè)稀釋度接胚5枚，0.1 ml/枚。雞胚置37℃孵育，每天早晚各照檢一次，逐胚收獲72～96 h死胚及96 h活胚尿囊液，并分別測(cè)定每枚胚尿囊液的HA效價(jià)，選擇出現(xiàn)病毒感染最高稀釋度的一枚胚，收獲雞胚尿囊液作為傳代接種物。按上述方法進(jìn)行病毒的接種及傳代。共經(jīng)3次純化傳代后，將純化毒種稀釋至10-3，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，37℃孵育。每6 h照蛋一次，至96 h時(shí)取出全部雞胚，逐胚收集72～96 h死胚及96 h活胚尿囊液，測(cè)定毒價(jià)、分裝，-70℃保存、備用。

2.病毒的鑒定。

(1)血凝(HA)、血凝抑制(HI)試驗(yàn)：采集健康公雞的紅細(xì)胞，配制成1%雞紅細(xì)胞，按《中華人民共和國獸藥典的》(2010版)的方法，進(jìn)行微量凝集試驗(yàn)，測(cè)定血凝價(jià)后，分 別 用 AIV H9、AIV H5、NDV、EDS-76標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行HI試驗(yàn)。

(2)RT-PCR鑒 定：按 照 病毒RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行病毒RNA的制備，基因擴(kuò)增方法采用RT-PCR方法獲得，PCR反應(yīng)體系為：雙蒸滅菌水37.5μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4μl，上游引物0.5μl，下游引 物 0.5μl，10×PCR Buffer 5μl，2.5 mM dNTPs 2μl，Ex-Taq DNA聚合酶 0.5μl。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠上電泳檢查，觀察結(jié)果。

3.HA基因的測(cè)序。HA全基因PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳鑒定片段大小正確后，送交Life Technologies公司進(jìn)行測(cè)序。

4.分離毒病毒含量測(cè)定(EID50測(cè)定)。將純化后病毒雞胚尿囊液用滅菌PBS作10倍系列稀釋，取10-7、10-8、10-93個(gè)稀釋度的病毒液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每個(gè)稀釋度接種5枚，0.1 ml/枚，置37℃孵育，每天早晚各照檢一次，及時(shí)取出死胚置4℃冰箱中保存，觀察至120 h。逐胚收集24～120 h死胚及120 h活胚尿囊液，進(jìn)行HA檢測(cè)，以HA≥4 log2判為雞胚感染，按Reed-Muench方法計(jì)算EID50。

表1 引物序列

表2 分離毒純化結(jié)果

表3 分離毒傳代結(jié)果

二、結(jié)果

1.病毒分離及純化。病料及棉拭子上清接種SPF雞胚后，收獲雞胚尿囊液，進(jìn)行HA檢測(cè)，分離毒有血凝性，血凝價(jià)為7 log2。檢查死亡的胚體，有明顯的彌漫性出血，以頭部及爪子最為明顯。分離毒純化傳代后(詳見表2)，病毒趨于穩(wěn)定。雞胚死亡呈現(xiàn)規(guī)律性，死亡胚體有流感病毒的特征性病變，死亡時(shí)間集中在70～96 h，HA效價(jià)達(dá)10 log2(詳見表 3)。分 別 為 108.38、108.50、108.50EID50/0.1 ml。

圖1 H9N2亞型禽流感RT-PCR鑒定結(jié)果(注：1.DL2000；2.N2；3.N2陰性對(duì)照；4.H9；5.H9陰性對(duì)照)

5.HA基因cDNA序列分析。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增所得的YB毒株基因編碼區(qū)均由1683個(gè)核苷酸組 成， 與AIV(H9N2)經(jīng)典毒株及近年分離的流行毒株比對(duì)分析結(jié)果(見圖2、圖3)，YB與近年流行毒株的核苷酸同源性在94.9%～97.9%，

圖2 不同毒株H9N2毒株HA基因核苷酸序列的同源性分析

圖3 不同毒株H9N2毒株HA基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.血清學(xué)鑒定。血凝抑制試驗(yàn)表明，該分離毒血凝作用不被新城疫病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒和禽流感病毒H5亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清抑制，而被禽流感病毒H9亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清抑制，血凝抑制價(jià)為9 log2。

3.RT-PCR鑒定。分離毒純化后進(jìn)行H9基因及N2基因鑒定，分別能擴(kuò)增出732 bp、377 bp的片段(結(jié)果見圖1)。

4.毒價(jià)測(cè)定。分離毒純化傳代后， 經(jīng) 測(cè) 定：E5、E6、E7代 毒 價(jià)與國內(nèi)經(jīng)典株Ck/Beij/1/94株和Ck/Shangh/F/98株同源性分別為92.2%和91.3%。對(duì)由核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，裂解位點(diǎn)的氨基酸序列均為K S S R↓G。

三、討論

從病死雞中分離到的禽流感病毒YB株，該病毒有血凝性，且凝集不被新城疫病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒和禽流感病毒H5亞型抗血清抑制，而被禽流感病毒H9亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清抑制；通過RT-PCR方法進(jìn)行AIV H9亞型和N2亞型鑒定后，能夠擴(kuò)增出AIV H9亞型和N2亞型的特異性片段，證明分離到的毒株為AIV H9N2亞型病毒。分離株的裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為K S S R↓G，符合低致病性禽流感的特點(diǎn)。

YB分離株與我國最早分離到的H9N2的禽流感毒株Ck/Beij/1/94毒株基因序列進(jìn)行同源性比較，同源性僅為92.2%，分離株與近年流行毒株的基因序列比較，其核苷酸一致性為94.9%～97.9%。在序列比對(duì)中CK JS CZ 2011株和CK GX 1 2011株為本實(shí)驗(yàn)室于2011年分離的AIV H9N2毒株，本次研究中分離的YB株HA基因核苷酸與上述二者的一致性僅為95%和94.9%，表明該毒株雖然仍屬于近年的流行株，但近年臨床流行的AIV H9N2毒株仍在不斷地發(fā)生變異。該分離株純化后在雞胚上擴(kuò)增后，血凝價(jià)和病毒含量分別 可 達(dá) 10log2、108.50EID50/0.1 ml，明顯高于王英珍等、楊其峰等分離的禽流感H9N2亞型病毒，推測(cè)該病毒株在及雞胚上的適應(yīng)性較強(qiáng)。且該毒株在雞胚上擴(kuò)增后HA效價(jià)及病毒含量非常穩(wěn)定，可作為疫苗株的備選毒株。但該毒株與臨床流行毒株的免疫交叉保護(hù)性還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

略)