江永青，胡志堅，盧 敏，韓 峰，荀春華

(九江學(xué)院附屬醫(yī)院，江西 九江 332000)

全世界每年有超過100萬人死于肺癌，國內(nèi)肺癌的發(fā)病率和死亡率占城市惡性腫瘤的首位。合理化療是有效抑制腫瘤發(fā)展，提高患者生命質(zhì)量、延長生存期的重要途徑。然而，目前腫瘤藥物敏感實驗常用MTT 法，此方法持續(xù)時間長、干擾因素多、且難以量化，以至醫(yī)生難以及時準(zhǔn)確用藥。此外，目前藥敏標(biāo)本常來源于手術(shù)切除物，但大多肺癌患者就診時已錯過最佳手術(shù)期。為此我們采試用快速、準(zhǔn)確的流式細(xì)胞術(shù)對纖支鏡標(biāo)本進(jìn)行腫瘤藥敏試驗，為臨床醫(yī)生根據(jù)個體差異選擇治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2010-2011年在本院住院的患者92例，其中男61例，女31例，年齡46-78歲，經(jīng)病理及影像學(xué)檢查證實為非小細(xì)胞肺癌者。根據(jù)患者用藥情況，將其分成兩組：實驗組48例(經(jīng)藥敏實驗指導(dǎo)給藥)和對照組44例(根據(jù)醫(yī)生經(jīng)驗給藥)，兩組的病情、性別、年齡、飲食習(xí)慣、職業(yè)及文化程度均無顯著性差異。

1.2 方法 標(biāo)本在取出后，應(yīng)用機(jī)械法將其分離成單細(xì)胞懸液，用不連續(xù)密度梯度離心法純化細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀的凋亡檢測技術(shù)檢測活細(xì)胞數(shù)>90%。細(xì)胞重懸于10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 IU／ml 青霉素及鏈霉素)，將細(xì)胞濃度調(diào)至1×105個/ml，接種24 孔板，每孔300μl細(xì)胞懸液，每種藥物及組合設(shè)5個平行復(fù)孔。根據(jù)血藥濃度將化療藥物分別加入各孔，分別長春瑞濱(NVB，2.40μg/ml),紫杉醇(PTX,3.60μg/ml),多西紫杉醇(DT,5.00μg/ml),吉西他濱(GEM,46.00μg/ml)，順鉑(CDDP,400.00μg/ml)，卡鉑(CBP,100.00μg/ml)，依托泊苷(VP-16,9.40μg/ml),長春瑞濱 (2.40μg/ml)+順鉑 (400.00μg/ml),依托泊苷(9.40μg/ml)+順鉑(400.00μg/ml),吉西他濱(46.00μg/ml)+順鉑 (400.00μg/ml)。加藥后12h 收獲細(xì)胞約1×105個移人試管，PBS 洗滌1次，400μl Binding Bufer 重懸細(xì)胞。取200μl細(xì)胞懸液加入Annexin V5μl，PI10μl 避光20min，加入200μl Binding Buffer 上機(jī)檢測。用Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù)，Mod-Fit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得出每組的凋亡率。腫瘤細(xì)胞凋亡率=加藥組凋亡率-對照組凋亡率。根據(jù)藥敏結(jié)果選擇凋亡率最高的藥物或藥物組合，指導(dǎo)臨床用藥。根據(jù)RECIST 標(biāo)準(zhǔn)對兩組進(jìn)行療效評價，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)和進(jìn)展(PD)，以CR+PR 計算有效率(RR)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗結(jié)果 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞經(jīng)單藥和聯(lián)合用藥的體外藥敏試驗結(jié)果，見表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞經(jīng)單藥和聯(lián)合用藥的體外藥敏比較

2.2 治療效果比較 實驗組與對照組治療效果比較，見表2。

表2 兩組治療效果比較[n(%)]

3 討論

化療是肺癌治療中重要環(huán)節(jié)，尤其是在消除肺癌的微轉(zhuǎn)移灶，控制中晚期肺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面具有不可替代的作用，是多學(xué)科治療中一個主要的重要組成部分。目前肺癌化療單藥有100 多種，臨床醫(yī)師在制定化療方案時多根據(jù)經(jīng)驗用藥，但由于腫瘤患者個體差異較大，不同類型的腫瘤對藥物的敏感性亦不相同，即便是同一類型也存在著較大差異，由此導(dǎo)致化療效果并不太理想。而腫瘤細(xì)胞體外化療藥物敏感試驗的開展，對選擇敏感化療藥物、實現(xiàn)對腫瘤患者的個體化治療、減少盲目性和耐藥的發(fā)生具有極其重要的臨床意義。Sargent[2]總結(jié)了十多年的腫瘤藥敏結(jié)果，發(fā)現(xiàn)卵巢癌體外試驗結(jié)果與體內(nèi)應(yīng)用結(jié)果具相關(guān)性，且體外敏感藥和不敏感藥進(jìn)行治療后的5年生存率，前者高于后者。Von Hof[3]報道腫瘤體外藥敏試驗結(jié)果與體內(nèi)療效符合率為84.7%，陽性結(jié)果符合率為92.2%，陰性結(jié)果符合率為69.1%。這都說明了腫瘤藥敏試驗結(jié)果對臨床用藥的指導(dǎo)意義。理想的藥物敏感試驗應(yīng)具備的條件是簡單、快速、敏感，可篩選作用方式不同的藥物。Schrag D[4]等認(rèn)為不管何種技術(shù)，體外實驗結(jié)果一定要與藥物體內(nèi)療效有較好的符合率。

然而，目前腫瘤藥物敏感實驗常用MTT 法，此方法所獲結(jié)果受多方因素的影響，如各復(fù)孔間誤差、加藥濃度、加藥時間、MTT 作用時間、溶解劑作用時間等。MTT 法持續(xù)時間長、干擾因素多、且難以量化，以至醫(yī)生難以及時準(zhǔn)確用藥。由于臨床上用于腫瘤治療的大多數(shù)抗癌藥物都可在不同類型的腫瘤治療中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是決定化療效果的重要因素[5,6]，而流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡快速、準(zhǔn)確，使其在臨床腫瘤藥敏試驗的應(yīng)用成為必然趨勢。姚靜[7]等對抗腫瘤藥物敏感性的實驗方法進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞術(shù)可以檢測到早期凋亡，檢測到藥物最大殺傷率的有效時間點(diǎn)明顯早于MTT比色法。

此外，目前藥敏標(biāo)本常來源于手術(shù)切除物，但大多肺癌患者就診時已錯過最佳手術(shù)期。本次試驗以纖支鏡標(biāo)本為試驗對象，可增加試驗者范圍，減少患者取材的痛苦，又可充分發(fā)揮流式細(xì)胞術(shù)所需標(biāo)本量少的優(yōu)勢。

我們用快速、準(zhǔn)確的流式細(xì)胞術(shù)對纖支鏡標(biāo)本進(jìn)行肺癌體外藥敏試驗，以指導(dǎo)臨床合理用藥。試驗結(jié)果顯示，各種化療藥物的敏感度不同，而且沒有對所有病人都敏感的藥物，因此每種藥物對個體病人的有效性不一。實驗組的有效率為72.91%，明顯高于對照組(40.91%),表明針對個體組成的合理化療方案對病情的控制明顯高于僅憑經(jīng)驗的普通化療方案。因此我們應(yīng)篩選出較敏感的化療藥物，組成合理的化療方案，將化療具體到每一個肺癌病人，指導(dǎo)臨床治療，爭取取得最佳的診療效果，以延長患者生存期和改善生活質(zhì)量。

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[2]Sargent JM.The use of the MTT assay to study drug resistance infresh tumour samples[J].Cancer Res，2003，161(1) ∶13-25.

[3]Von Hoff DD.In vitro predictive testing:the sulfonamide era[J].Int J Cell Cloning.1987.5(3):179-190.

[4]Schrag D,Garewal HS,Burstein HJ,et al.American society of clinical oncology technology assessment:chemotherapy sensitivity and resistance assays[J].Clin Oncol,2004,22:3631-3638.

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[6]Hu W,Kavanagh JJ.Anticancer therapy targeting the apoptotic pathway[J].Lancet Oncol,2003,4(12):721.

[7]姚 靜,李小蘭,李偉華,等.抗腫瘤藥物敏感性實驗方法的比較.中華實驗外科雜志[J]，2005，7：792-793.