曲媛媛，任南琪

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實驗室，黑龍江哈爾濱150090)

氫氣是安全、清潔、高效、環(huán)境友好的可再生能源，是一種化石能源的理想替代品.厭氧發(fā)酵法生物制氫技術(shù)因其經(jīng)濟(jì)、條件溫和，可有效利用多種廢物制取等諸多優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[1-2].厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫過程受多種環(huán)境因子的制約和影響，如溫度、pH、氧化還原電位、底物、金屬離子以及還原劑等.因此，可以從調(diào)整和優(yōu)化環(huán)境因子的角度來考慮提高生物制氫系統(tǒng)的產(chǎn)氫能力，已有研究者探討了部分環(huán)境因子對產(chǎn)氫系統(tǒng)的影響以及參考參數(shù)[3-5].厭氧發(fā)酵制氫過程適宜在較低的氧化還原電位條件下進(jìn)行，而L-半胱氨酸作為一種具有特殊結(jié)構(gòu)的有效還原劑[6]，能夠起到降低并保持厭氧環(huán)境的氧化還原電位在較低水平的作用.已有研究證實，L-半胱氨酸在一定范圍內(nèi)提高了純培養(yǎng)細(xì)菌的產(chǎn)氫能力[7].也有研究者將L-半胱氨酸作為生物活性劑來提高混合培養(yǎng)微生物的產(chǎn)氫能力，產(chǎn)氫效率提高了1.5～2.9 倍[8].但目前已有關(guān)于 L-半胱氨酸促進(jìn)產(chǎn)氫的研究成果大多是針對間歇培養(yǎng)的發(fā)酵系統(tǒng)，針對連續(xù)流系統(tǒng)的研究尚缺乏.因此，為了進(jìn)一步明確和優(yōu)化L-半胱氨酸對連續(xù)流厭氧發(fā)酵生物制氫的促進(jìn)作用，進(jìn)而為工程應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考，本文采用兩組平行的反應(yīng)系統(tǒng)模型，分別從氧化還原電位、生物量、產(chǎn)酸發(fā)酵以及產(chǎn)氫能力的角度對L-半胱氨酸對連續(xù)流厭氧發(fā)酵生物制氫系統(tǒng)的影響展開研究.

1 連續(xù)流發(fā)酵制氫試驗材料與方法

1.1 試驗裝置

本試驗采用2個相同的有機(jī)玻璃制成的連續(xù)流攪拌槽式反應(yīng)器(CSTR)模型，反應(yīng)器有效容積1 L，內(nèi)設(shè)氣、液、固三相分離裝置，為反應(yīng)區(qū)和沉淀區(qū)一體化結(jié)構(gòu).模型設(shè)有攪拌裝置，通過軸封保證反應(yīng)區(qū)密閉.采用計量泵以恒定流量將試驗進(jìn)水從進(jìn)水箱泵入反應(yīng)器內(nèi).以在反應(yīng)器外壁纏繞電熱線的方式加熱并保溫，利用溫控儀將反應(yīng)器內(nèi)溫度控制在(35±1)℃.試驗裝置如圖1所示.

圖1 CSTR生物制氫反應(yīng)器示意Fig.1 Schematic diagram of the CSTR reactor

1.2 試驗廢水與接種污泥

試驗廢水由甜菜制糖廠排出的糖蜜廢水經(jīng)人工稀釋而成.配水時投加一定量的農(nóng)用復(fù)合肥，保證質(zhì)量濃度比 ρ(COD)∶ρ(N)∶ρ(P)為 1 000∶5∶1 左右，以提供活性污泥生長過程的營養(yǎng)需求.

接種污泥取自哈爾濱市政污水排放溝底泥，接種前先用糖蜜廢水及少量N、P曝氣進(jìn)行培養(yǎng)馴化，接種時揮發(fā)性懸浮固體質(zhì)量濃度為6.5 g/L.

1.3 反應(yīng)器啟動與運(yùn)行

兩反應(yīng)器分別編號為1號和2號，啟動COD容積負(fù)荷均為7.0 kg/m3·d，水力停留時間均為6 h.采用逐步提高COD濃度的方式提升有機(jī)容積負(fù)荷，提升策略如表1所示.其中2號反應(yīng)器在配水時加入0.1 g/L的L-半胱氨酸，隨進(jìn)水一同泵入反應(yīng)器內(nèi)，1號反應(yīng)器不添加L-半胱氨酸.

表1 COD容積負(fù)荷Table 1 COD volume loading rate

1.4 分析方法

COD、揮發(fā)性懸浮固體質(zhì)量濃度(MLVSS)和混合液懸浮固體質(zhì)量濃度(MLSS)按照美國1998年制定的APHA標(biāo)準(zhǔn)方法測定[9].pH和氧化還原電位(ORP)采用pHS-25型酸度計測量.發(fā)酵氣體流量采用LML-1型濕式氣體流量計計量.

液相末端發(fā)酵產(chǎn)物(VFAs)組分及含量由標(biāo)準(zhǔn)GC-122型氣相色譜儀分析，采用氫火焰檢測器，配置的不銹鋼填充柱長2.0 m，內(nèi)徑5 mm，擔(dān)體為GDX-103 型(粒徑0.18～0.25 mm)，氣化室、填充柱和檢測室溫度分別為220℃、190℃和220℃，以氮?dú)鉃檩d氣，流速30 mL/min.發(fā)酵氣組分及含量由SC-Ⅱ型氣相色譜儀分析，熱傳導(dǎo)式檢測器(TCD)，不銹鋼填充柱長2.0 m、內(nèi)徑5 mm、擔(dān)體Porapak Q(粒徑177～297 μm)，由柱式加熱爐加熱，檢測器溫度 150℃，以氮?dú)鉃檩d氣，流速 40 mL/min[10].

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 L-半胱氨酸對氧化還原電位和pH的影響

厭氧系統(tǒng)的氧化還原電位和pH都是影響微生物代謝的重要環(huán)境因子.在厭氧發(fā)酵過程中，微生物細(xì)胞的酶活性以及微生物的生長繁殖都會受氧化還原電位影響.微生物的厭氧發(fā)酵制氫過程也需要在適宜的氧化還原電位條件下進(jìn)行，研究發(fā)現(xiàn)乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵的適宜氧化還原電位在-450 mV以下[11].兩反應(yīng)器運(yùn)行過程中的氧化還原電位和pH變化情況如圖2所示.

由圖可知，添加了L-半胱氨酸的2號反應(yīng)器氧化還原電位在啟動的第1天就迅速降至約-400 mV，之后逐漸穩(wěn)定在-450 mV左右;而未添加L-半胱氨酸的1號反應(yīng)器氧化還原電位則經(jīng)歷了相對逐漸降低的過程，隨著反應(yīng)器內(nèi)溶解氧的消耗，氧化還原電位大約在啟動后第10天降至-400 mV，之后逐漸穩(wěn)定在 -430～-440 mV.2號反應(yīng)器中L-半胱氨酸的添加起到了還原劑的作用，迅速降低了系統(tǒng)的氧化還原電位，在啟動初期就創(chuàng)造出適宜進(jìn)行乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵的環(huán)境，過渡期較短，而未添加L-半胱氨酸的1號反應(yīng)器則經(jīng)歷了相對較長的過渡期.

圖2 兩反應(yīng)器氧化還原電位(ORP)和pH變化情況Fig.2 Oxidation-reduction potential and pH in two reactors

此外，由圖2可見，運(yùn)行過程中兩反應(yīng)器的pH都迅速下降并保持在4.5左右的酸性環(huán)境，這是由于微生物進(jìn)行乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵的代謝過程中產(chǎn)生大量以小分子有機(jī)酸和醇為主的液相末端產(chǎn)物，同時這也符合乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵進(jìn)行的生態(tài)位條件[12].

2.2 L-半胱氨酸對生物量的影響

圖3為運(yùn)行過程中兩反應(yīng)器內(nèi)的生物量變化情況.由圖可見，兩反應(yīng)器中的揮發(fā)性懸浮固體質(zhì)量濃度在啟動運(yùn)行過程中都經(jīng)歷了先減少再逐漸增加的過程.這是由于在啟動初期，微生物的生長環(huán)境發(fā)生變化，剛剛由曝氣狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬醢l(fā)酵狀態(tài)，部分不能適應(yīng)厭氧環(huán)境的微生物被淘汰出系統(tǒng)，因此產(chǎn)生了一定量的污泥流失，生物量下降.在第6天后，隨著COD容積負(fù)荷提升，生物量也開始逐漸增加，且2號反應(yīng)器在啟動前期生物量的增長尤為明顯.在第6～11天的時間里，1號反應(yīng)器的揮發(fā)性懸浮固體質(zhì)量濃度由3.9 g/L增長至5.2 g/L，而2號反應(yīng)器則由3.8 g/L迅速增長至6.9 g/L.到運(yùn)行結(jié)束時，1號和2號反應(yīng)器中的揮發(fā)性懸浮固體質(zhì)量濃度分別達(dá)到了9.5 g/L和10.2 g/L.2號反應(yīng)器中的L-半胱氨酸在啟動初期就迅速降低了系統(tǒng)內(nèi)的氧化還原電位，使得微生物一開始就處于適宜乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵的環(huán)境中，因此在淘汰了不能適應(yīng)環(huán)境的菌群之后，乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵細(xì)菌很快就得以大量生長繁殖，生物量增長迅速.而1號反應(yīng)器中的微生物則隨著環(huán)境的逐漸過渡相對緩慢增長.

圖3 兩反應(yīng)器生物量變化情況Fig.3 Biomass variation in two reactors

另外，如圖3所示，2號反應(yīng)器的揮發(fā)性懸浮固體質(zhì)量濃度占混合液懸浮固體質(zhì)量濃度的百分比高于1號反應(yīng)器，說明添加了L-半胱氨酸的反應(yīng)器中污泥的可生化性更好，活性高.

2.3 L-半胱氨酸對液相末端發(fā)酵產(chǎn)物的影響

微生物厭氧發(fā)酵制氫過程產(chǎn)生大量以小分子有機(jī)揮發(fā)酸和醇為主的液相末端發(fā)酵產(chǎn)物，以乙醇和乙酸為主要產(chǎn)物的乙醇型發(fā)酵是一種有利于產(chǎn)氫進(jìn)行的發(fā)酵類型[13].兩反應(yīng)器啟動運(yùn)行過程中的液相末端發(fā)酵產(chǎn)物變化情況如圖4所示.

圖4 兩反應(yīng)器液相末端發(fā)酵產(chǎn)物變化情況Fig.4 Liquid end metabolites in two reactors

由圖4可見，運(yùn)行初期，兩反應(yīng)器都沒有表現(xiàn)出典型的發(fā)酵類型，除了乙酸含量較高，其他代謝產(chǎn)物含量接近且很少，處于混合酸發(fā)酵狀態(tài).在第14天后，2號反應(yīng)器中的丙酸和丁酸含量迅速降低，乙醇、乙酸含量持續(xù)增加，而此時的1號反應(yīng)器并未表現(xiàn)出向某一種發(fā)酵類型轉(zhuǎn)化的趨勢.在第21天開始，2號反應(yīng)器出現(xiàn)比較明顯的向乙醇型發(fā)酵轉(zhuǎn)化的趨勢，并且乙醇和乙酸的總量在第25天后穩(wěn)定在80%以上，進(jìn)入穩(wěn)定的乙醇型發(fā)酵運(yùn)行階段，此時乙醇和乙酸含量分別為1 100 mg/L和950 mg/L左右.而1號反應(yīng)器的混合酸發(fā)酵階段則持續(xù)時間較長，乙醇和乙酸含量在第25天后才開始明顯上升，第35天后表現(xiàn)為穩(wěn)定的乙醇型發(fā)酵，穩(wěn)定時乙醇和乙酸含量分別為820 mg/L和750 mg/L左右.且2號反應(yīng)器中的液相末端發(fā)酵產(chǎn)物總量始終高于1號.上述結(jié)果表明，盡管兩反應(yīng)器經(jīng)歷了相似的復(fù)雜的群落演替過程，乙醇型發(fā)酵菌群逐漸成為優(yōu)勢種群，但L-半胱氨酸的添加加速了群落演替進(jìn)程，從而加快了連續(xù)流制氫系統(tǒng)的啟動速度，縮短了不穩(wěn)定的過渡階段，并提高了液相末端發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量.這也是由于L-半胱氨酸快速創(chuàng)造了適宜乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵進(jìn)行的低氧化還原電位環(huán)境，縮短了乙醇型產(chǎn)氫細(xì)菌淘汰其他菌種而占據(jù)優(yōu)勢地位的時間，并使其在適宜的環(huán)境中快速生長繁殖，從而增加了代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量.

2.4 L-半胱氨酸對產(chǎn)氫能力的影響

兩反應(yīng)器運(yùn)行過程中的產(chǎn)氫情況如表2所示.可見，在運(yùn)行初期，兩反應(yīng)器產(chǎn)氫量均很少，1號與2號反應(yīng)器的產(chǎn)氫速率分別在第25天和第21天之后開始顯著提升，而此時也正是兩反應(yīng)器分別開始表現(xiàn)出乙醇型發(fā)酵趨勢的階段.到運(yùn)行結(jié)束時，1號和2號反應(yīng)器的產(chǎn)氫速率分別達(dá)到了2.99 L/d和3.06L/d.L-半胱氨酸的加入加快了2號反應(yīng)器的啟動速度，使其較早地進(jìn)入穩(wěn)定產(chǎn)氫發(fā)酵階段，并增加了系統(tǒng)的生物量，提高了微生物活性，因此相對于1號反應(yīng)器，添加了L-半胱氨酸的2號反應(yīng)器產(chǎn)氫速率提高時間較早且產(chǎn)氫速率較高.

表2 兩反應(yīng)器產(chǎn)氫情況Table 2 Hydrogen production of two reactors

為了考察微生物的產(chǎn)氫活性，以單位質(zhì)量揮發(fā)性懸浮固體的產(chǎn)氫速率作為本試驗生物比產(chǎn)氫速率的衡量指標(biāo)，以單位COD消耗量的產(chǎn)氫量作為本試驗底物比產(chǎn)氫量的衡量指標(biāo).由表2可見，在第21天左右，2號反應(yīng)器的生物比產(chǎn)氫速率為44 mL/g·d，1 號為30 mL/(g·d)，2 號明顯高于1號，此時2號反應(yīng)器已開始由混合酸發(fā)酵向乙醇型發(fā)酵轉(zhuǎn)化，而1號反應(yīng)器仍處于混合酸發(fā)酵階段.在其他階段，2號與1號反應(yīng)器的比產(chǎn)氫速率相差不大.說明在2號反應(yīng)器產(chǎn)氫活性明顯高于1號反應(yīng)器的階段，主要是由于2號反應(yīng)器中L-半胱氨酸的加入促進(jìn)了微生物的群落演替，乙醇型發(fā)酵產(chǎn)氫菌群大量繁殖，淘汰其他種群，表現(xiàn)為微生物產(chǎn)氫活性明顯提高.而在兩反應(yīng)器各自完成種群更替，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，二者的微生物產(chǎn)氫活性相差不大.同時可見，1號反應(yīng)器的底物比產(chǎn)氫量在前21天波動較大，這也是由于在種群更替過程中，微生物種類和數(shù)量的復(fù)雜變化導(dǎo)致了COD去除率的大幅波動.而2號反應(yīng)器的底物比產(chǎn)氫量在啟動前期雖然也有波動，但系統(tǒng)環(huán)境相對迅速達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，種群更替較快，因此波動幅度相對較小.2號反應(yīng)器的底物比產(chǎn)氫量在整個啟動過程中略高于1號，但相差并不大.在已有的間歇式培養(yǎng)研究中，L-半胱氨酸將混合培養(yǎng)微生物的產(chǎn)氫效率提高了 1.5～2.9 倍[8]，高于本研究中L-半胱氨酸對連續(xù)流發(fā)酵制氫的促進(jìn)作用，這也與連續(xù)流系統(tǒng)復(fù)雜的環(huán)境以及變化的操作控制參數(shù)有關(guān).

3 結(jié)論

1)L-半胱氨酸能夠迅速降低連續(xù)流發(fā)酵制氫系統(tǒng)的氧化還原電位，創(chuàng)造出適宜乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵的環(huán)境，從而加快系統(tǒng)的啟動進(jìn)程，縮短不穩(wěn)定的過渡期，將平行運(yùn)行條件下的啟動時間由35 d縮短到25 d.

2)L-半胱氨酸能夠在啟動期迅速提高制氫系統(tǒng)的生物量.達(dá)到穩(wěn)定運(yùn)行狀態(tài)時，未添加和添加了L-半胱氨酸的反應(yīng)器的揮發(fā)性懸浮固體質(zhì)量濃度分別為 9.5 g/L 和10.2 g/L.

3)L-半胱氨酸能夠促進(jìn)連續(xù)流制氫系統(tǒng)的產(chǎn)氫能力，在啟動期產(chǎn)氫平穩(wěn)較快且波動較小.添加了L-半胱氨酸的反應(yīng)器在啟動完成后的產(chǎn)氫速率達(dá)到3.06 L/d，而未添加的為 2.99L/d.

4)L-半胱氨酸提高產(chǎn)氫的作用主要在于促進(jìn)微生物的產(chǎn)氫及生長，在今后的研究中可以進(jìn)一步單獨(dú)從底物限制條件角度進(jìn)行探討，獲得參數(shù).

[1]WU S Y，HUNG C H，LIN C N，et al.Fermentative hydrogen production and bacterial community structure in highrate anaerobic bioreactors containing silicone-immobilized and self-flocculated sludge[J].Biotechnology and Bioenineering，2006，93(5):934-946.

[2]VALDEZ-VAZQUEZ I，POGGI-VARALDO H M.Hydrogen production by fermentative consortia[J].Renewable and Sustainable Energy Reviews，2009，13(5):1000-1013.

[3]SKONIECZNY M T，YARGEAU V.Biohydrogen production from wastewater by Clostridium beijerinckii:Effect of pH and substrate concentration[J].Int J Hydrogen Energy，2009，34(8):3288-3294.

[4]LIN C Y，WU C C，WU J H，et al.Effect of cultivation temperature on fermentative hydrogen production from xylose by a mixed culture[J].Biomass and Bioenergy，2008，32(12):1109-1115.

[5]KARLSSON A，VALLIN L，EJLERTSSON J.Effects of temperature，hydraulic retention time and hydrogen extraction rate on hydrogen production from the fermentation of food industry residues and manure[J].Int J Hydrogen Energy，2008，33(3):953-962.

[6]ESCARABAJAL D，MIQUEL M，ARAGON C M G.L-cysteine，a thiol amino acid，increases the stimulating acute effect of ethanol on locomotion [J].Alcohol，2001，25(2):83-88.

[7]CHEN H Q，MA X X，F(xiàn)AN D D，et al.Influence of L-cysteine concentration on oxidation-reduction potential and biohydrogen production[J].Chinese Journal of Chemical Engineering，2010，18(4):681-686.

[8]YUAN Z L，YANG H J，ZHI X H，et al.Enhancement effect of L-cysteine on dark fermentative hydrogen production[J].Int J Hydrogen Energy，2008，33(22):6535-6540.

[9]APHA，AWWA，WEF.Standard methods for the examination of water and wastewater[M].20th ed.Washington DC:APHA，1998:(5-1)-(5-72).

[10]任南琪，王寶貞.有機(jī)廢水發(fā)酵法生物制氫技術(shù)——原理與方法[M].哈爾濱:黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1994:47-63.

[11]宮曼麗.連續(xù)流生物制氫反應(yīng)器的定向啟動及群落演替規(guī)律[D].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2006:35-81.GONG Manli.Controlling strategy of directional start-up and community succession in continuous flow biohydrogen production reactors[D].Harbin:Harbin Institute of Technology，2006:35-81.

[12]任南琪，王愛杰，馬放.產(chǎn)酸發(fā)酵微生物生理生態(tài)學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社，2005:252-298.

[13]REN N Q，WANG B Z，HUANG J C.Ethanol-type fermentation from carbohydrate in high rate acidogenic reactor[J].Biotechnology and Bioenineering，1997，54(5):428-433.